古朵課堂——免疫組化抗原修復(fù)方法
 

　　大多數(shù)甲醛固定的組織在開始染色之前都需要先修復(fù)抗原，這是由于在固定過程中產(chǎn)生了亞甲基橋使蛋白之間交聯(lián)屏蔽了抗原位點(diǎn)。兩種抗原修復(fù)方法為熱修復(fù)法(稱之為熱誘導(dǎo)抗原表位修復(fù)或HIER)和酶解法。

　　一、熱修復(fù)法

　　1. 熱修復(fù)緩沖溶液

　　下面是三種HIER較為常用的緩沖溶液，對(duì)于一個(gè)特定的抗體，在沒有其他研究者建議的情況下，要通過實(shí)驗(yàn)確定選用哪種修復(fù)緩沖液。

　　1) g櫞酸鈉緩沖液(10 mM Sodium Citrate，0.05% 吐溫- 20, pH 6.0)

　　2) 1 mM EDTA, 調(diào)至pH 8.0

　　3) Tris/EDTA 緩沖液(10mM Tris, 1 mM EDTA 溶液， 0.05% 吐溫-20, pH 9.0)

　　2. 熱修復(fù)方法

　　a) 高壓蒸汽法

　　玻片要置于金屬架上

　　1)材料及試劑

　　• 家用不銹鋼高壓鍋

　　• 加熱板

　　• 玻片架放置容器(容量大約400-500ml)

　　• 抗原修復(fù)緩沖液(如Tris/EDTA pH 9.0，g櫞酸鈉pH 6.0)

　　2)方法

　　1. 將合適的抗原修復(fù)緩沖液加入高壓鍋內(nèi)，然后將鍋置于加熱板并開至最大功率，此時(shí)不要把蓋子蓋緊。在等待煮沸過程中，進(jìn)行脫蠟至水。

　　2.煮沸后，將玻片從自來水中取出放入高壓鍋內(nèi)。小心熱溶液- 使用鑷子。依照說明書加上加壓閥。

　　3.高壓鍋達(dá)到最大壓力后，維持3分鐘。

　　4.3分鐘過后，關(guān)掉加熱板，將高壓鍋取下放置。

　　5.打開高壓鍋閥門，冷水冷卻鍋身。壓力降下后，打開鍋蓋，冷水冷卻10分鐘。

　　6.繼續(xù)染色。

　　b) 微波法

　　1)材料和試劑

　　• 家用(850W)或科研專用微波爐

　　• 微波爐專用玻片放置架及容器(容量大約400-500ml)或染色缸

　　• 抗原修復(fù)緩沖液(如Tris/EDTA pH 9.0，g櫞酸鈉溶液pH 6.0，等等)

　　2)方法

　　1.將切片脫蠟至水。

　　2.向微波爐專用容器中加入合適的修復(fù)緩沖液。

　　3.從自來水中取出切片并放入容器中，置于微波爐內(nèi)。如果用家用微波爐，就將之開到最大功率至開始沸騰并煮沸20分鐘。如果采用科研專用微波爐，就將溫度設(shè)置在98°C維持20分鐘以修復(fù)抗原。

　　4.20分鐘后，取出容器放置水中冷卻10分鐘。小心熱溶液。

　　5.繼續(xù)染色。

　　c) 蒸煮鍋法

　　1)材料和試劑

　　• 蒸煮鍋

　　• 玻片放置架及容器(容量大約400-500ml，如果采用Tissue–Tek容器大約250ml)

　　• 抗原修復(fù)緩沖液(如Tris/EDTA pH 9.0，g櫞酸鈉溶液pH 6.0，等等)

　　2)方法

　　1.將切片脫蠟至水。

　　2.依據(jù)用戶手冊(cè)設(shè)置蒸煮鍋并預(yù)熱。

　　3.在燒瓶中加熱適量修復(fù)緩沖液并煮沸。

　　4.將盛放玻片架的容器放置蒸煮鍋中。

　　5.將熱修復(fù)緩沖液小心加到容器中，然后放入玻片架。也可以采用更簡(jiǎn)捷的操作，先向容器中加熱修復(fù)緩沖液再放入蒸煮鍋中。

　　6.加蓋。盛放緩沖液的容器也須配備蓋子。剛開始時(shí)玻片架可能會(huì)使修復(fù)溶液溫度降低，但幾分鐘內(nèi)會(huì)回升到95-100°C之間。

　　7.達(dá)到溫度后維持20分鐘。

　　8.20分鐘后，取出容器放置水中冷卻10分鐘。

　　9.組織染色。

　　二.酶解抗原修復(fù)法

　　a)滴管法

　　1)材料和試劑

　　• 37°C孵育箱

　　• 加濕器(恒溫箱自帶或在容器內(nèi)放入濕紙巾)

　　• 兩個(gè)盛TBS的玻片架容器

　　• 酶解抗原修復(fù)溶液(如y蛋白酶、w蛋白酶、蛋白酶K，等等)

　　2)方法

　　1.將y蛋白酶預(yù)熱至37°C。小心的將組織切片周圍的水吸干，然后吸取酶溶液滴加到切片上(一般50-100µl即可)。用吸管將酶溶液鋪蓋住整個(gè)切片，注意不要弄壞組織。

　　2.將玻片置于加濕器內(nèi)，然后37°C孵育。避免直接將玻片放入恒溫箱架子上，否則會(huì)因溫度不均影響染色質(zhì)量。盛放玻片的容器最好先預(yù)熱再放入恒溫箱內(nèi)。

　　3.10-20分鐘(需要優(yōu)化)后，取出玻片，流水沖洗3分鐘。

　　4.繼續(xù)染色。

　　b) 侵泡法

　　1)材料和試劑

　　• 37°C 水浴

　　• 玻片架及玻片架容器

　　• 酶解抗原修復(fù)溶液

　　2)方法

　　1.將水浴溫度設(shè)置為酶最適宜的溫度。向盛放玻片架的兩個(gè)容器中加入超純水。容器放入水浴中加熱。

　　2.按上述方法將切片脫蠟至水后放入水浴箱其中一個(gè)容器中加熱。

　　3.用水浴箱中另一個(gè)容器中的熱水制備酶解抗原修復(fù)緩沖液，然后將盛有緩沖液的容器放回水浴箱中重新加熱。

　　4.將加熱過的玻片放入酶溶液中10-20分鐘并間歇緩慢震蕩。取出玻片在流水下沖洗3分鐘，將酶漂洗干凈。

　　5.繼續(xù)染色。

　　熱修復(fù)法/酶解抗原修復(fù)法上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營(yíng)宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。