ELISA檢測噬菌體抗體與目的抗原的親和力實驗概要

　　本實驗利用ELISA檢測了噬菌體抗體與目的抗原的親和力。

　　主要試劑

　　1. 0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)

　　2. 1%BSA

　　3. HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體多抗

　　4. 2mol/L H2SO4

　　主要設(shè)備

　　1. 酶標(biāo)板

　　2. 酶標(biāo)儀

　　實驗步驟

　　1. 將抗原用PBS或0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)稀釋至10μg/ml;

　　2. 對于要檢測的每個克隆，至少包被2個孔，每孔用200μl稀釋抗原。同時包被陰性對照抗原。此外，包被陽性對照抗原，陽性對照抗原用anti-M13抗體;

　　3. 室溫包被1～2h，最好于4℃過夜包被，甩掉孔中液體，倒置于紙巾上空干。

　　4. 每孔中用至少200μl 1%BSA封閉，37℃1h。去掉液體后空干。

　　5. 將重組噬菌體事先用等體積的封閉液于室溫下封閉15min～30min，以封閉各種蛋白質(zhì)之間的非特異性結(jié)合位點。

　　以M13噬菌體作為陽性對照噬菌體，也按上述步驟操作。

　　6. 在每個包被抗原孔中，加入稀釋的重組噬菌體懸液200μl，37℃ 1～2h。在包被了陽性對照抗原的孔中，加入200μl陽性對照噬菌體。

　　7. 去掉孔中液體，倒置于紙巾上。將板浸入PBS/0.5% Tween20(PBST)中，振蕩趕走氣泡，將板取出。重復(fù)洗滌5遍。

　　8. 將板倒置于紙巾上，去掉所有液體。

　　9. 將HRP酶標(biāo)的Anti-M13抗體用封閉緩沖液稀釋至合適濃度。

　　10. 在每孔中加入200μl HRP/Anti-M13稀釋液。

　　11. 37℃溫育1h。按前述方法洗滌6次。

　　12. 每21ml 1×ABTS底物溶液中加入36μl 30% H2O2。在每孔中加入200μl。

　　13. 置室溫20～60min，直至出現(xiàn)適中的顏色反應(yīng)。加入2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。

　　14. 于415nm波長下用酶標(biāo)儀讀出光吸收值。良好的數(shù)據(jù)中，噬菌體抗體與篩選抗原的吸收值應(yīng)當(dāng)比陰性對照抗原的吸收值高2～3倍。

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