【古朵生物】微生物培養(yǎng)基配制和菌步驟

　　微生物培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料,由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型,對營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同,加之研究的目的不同,所以培養(yǎng)基的種類很多,使用的原料也各有差異,但從營養(yǎng)角度分析,微生物培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機鹽、生長素以及水分等.另外,培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓.

　　培養(yǎng)基是微生物實驗的,需要進行培養(yǎng)基配制和滅菌,那么微生物培養(yǎng)基該如何配制、培養(yǎng)基滅菌是否,滅菌后如何儲存?

　　培養(yǎng)基的制備

　　1、配制溶液

　　向容器內(nèi)加入所需水量的一部分,按照培養(yǎng)基的配方,稱取各種原料,依次加入使其溶解,最后補足所需水分,對蛋白胨、肉膏等物質(zhì),需加熱溶解,加熱過程所蒸發(fā)的水分,應(yīng)在全部原料溶解后加水補足.

　　配制固體培養(yǎng)基時,先將上述已配好的液體培養(yǎng)基煮沸,再將稱好的瓊脂加入,繼續(xù)加熱至融化,并不斷攪拌,以免瓊脂糊底燒焦.

　　2、調(diào)節(jié)pH值

　　用pH試紙(或pH計、氫離子濃度比色計)測試培養(yǎng)基的pH值,如不符合需要,可用10%HCl或10%NaOH進行調(diào)節(jié),直到調(diào)節(jié)到配方要求的pH值為止.

　　3、過濾

　　用濾紙、紗布或棉花趁熱將已配好的培養(yǎng)基過濾.用紗布過濾時,最好折疊成六層,用濾紙過濾時,可將濾紙折疊成瓦棱形,鋪在漏斗上過濾.

　　4、分裝

　　已過濾的培養(yǎng)基應(yīng)進行分裝.如果要制作斜面培養(yǎng)基,須將培養(yǎng)基分裝于試管中.如果要制作平板培養(yǎng)基或液體、半固體培養(yǎng)基,則須將培養(yǎng)基分裝于錐形瓶內(nèi).分裝時,一手捏松彈簧夾,使培養(yǎng)基流出,另一只手握住幾支試管或錐形瓶,依次接取培養(yǎng)基.分裝時,注意不要使培養(yǎng)基粘附管口或瓶口,以免浸濕棉塞引起雜菌污染.裝入試管的培養(yǎng)基量,視試管和錐形瓶的大小及需要而定.一般制作斜面培養(yǎng)基時,每只15×150毫米的試管,約裝3至4毫升(1/4至1/3試管高度),如制作深層培養(yǎng)基,每只20×220毫米的試管約裝12至15毫升.每只錐形瓶裝入的培養(yǎng)基,一般以其容積的一半為宜.

　　5、加棉塞

　　分裝完畢后,需要用棉塞堵住管口或瓶口.堵棉塞的主要目的是過濾空氣,避免污染.棉塞應(yīng)采用普通新鮮、干燥的棉花制作,不要用脫脂棉,以免因脫脂棉吸水使棉塞無法使用.制作棉塞時,要根據(jù)棉塞大小將棉花鋪展成適當厚度,揪取手掌心大小一塊,鋪在左手拇指與食指圈成的圓孔中,用右手食指插入棉花中部,同時左手食指與姆指稍稍緊握,就會形成1個長棒形的棉塞.棉塞作成后,應(yīng)迅速塞入管口或瓶口中,棉塞應(yīng)緊貼內(nèi)壁不留縫隙,以防空氣中微生物沿皺折侵入.棉塞不要過緊過松,塞好后,以手提棉塞、管、瓶不下落為合適.棉塞的2/3應(yīng)在管內(nèi)或瓶內(nèi),上端露出少許棉花便于拔取.塞好棉塞的試管和錐形瓶應(yīng)蓋上厚紙用繩捆札,準備滅菌.

　　6、制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基

　　培養(yǎng)基滅菌后,如制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基,須趁培養(yǎng)基未凝固時進行.

　　(1)制作斜面培養(yǎng)基.在實驗臺上放1支長0.5至1米左右的木條,厚度為1厘米左右,將試管頭部枕在木條上,使管內(nèi)培養(yǎng)基自然傾斜,凝固后即成斜面培養(yǎng)基.

　　(2)制作平板培養(yǎng)基.將剛剛滅過菌的盛有培養(yǎng)基的錐形瓶和培養(yǎng)皿放在實驗臺上,點燃酒精燈,右手托起錐形瓶瓶底,左手拔下棉塞,將瓶口在酒精燈上稍加灼燒,左手打開培養(yǎng)皿蓋,右手迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中,每皿約倒入10毫升,以鋪滿皿底為度.鋪放培養(yǎng)基后放置15分鐘左右,待培養(yǎng)基凝固后,再5個培養(yǎng)皿一疊,倒置過來,平放在恒溫箱里,24小時后檢查,如培養(yǎng)基末長雜菌,即可用來培養(yǎng)微生物.

　　培養(yǎng)基滅菌效果的影響因素有哪些

　　1、營養(yǎng)成分的保持

　　濕熱滅菌時,微生物被殺死的同時,培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分也遭到了一定的破壞,特別是氨基酸和維生素.如在121攝氏度,僅20分鐘,就有59%的賴氨酸和及其他堿性氨基酸被破壞,蛋氨酸和也有相當數(shù)量被破壞.在熱的作用下某些營養(yǎng)成分還可能因受熱而相互之間發(fā)生反應(yīng),造成培養(yǎng)基中原有營養(yǎng)成分的數(shù)量變化,因而影響培養(yǎng)基質(zhì)量.

　　2、微生物的耐熱性

　　細菌芽孢的熱阻較大,滅菌所需要的時間取決于把細菌芽孢減少到所規(guī)定數(shù)目的時間.

　　3、pH值

　　pH值對微生物的耐熱性影響很大.pH值介于6.0~8.0時,微生物最不易死亡.pH<6.0時,微生物比較容易死亡,此時H+很容易滲入微生物的細胞,從而改變細胞的生理反應(yīng),促使其死亡.所以培養(yǎng)基的pH越低,所需的時間也越短.

　　4、培養(yǎng)基成分

　　油脂、糖類及蛋白質(zhì)等組成的高濃度有機物會包于細胞的周圍形式一層薄膜、影響熱的傳導(dǎo).而高濃度的鹽類、色素則削弱其耐熱性,滅菌較易.例如:大腸桿菌在水中加熱至60-65攝氏度便死亡,在10%糖液中需70攝氏度加熱4-6分鐘才死亡,在30%糖液中需30分鐘才死亡.一般糖類含量較多的時候最好選用115攝氏度,30分鐘;一般的培養(yǎng)基可選擇121攝氏度20分鐘.

　　5、泡沫

　　泡沫中的空氣形成隔熱層,使熱量難以滲透進去,殺死其中的雜菌.

　　6、顆粒

　　顆粒小,容易滅菌,顆粒大,則難滅菌.對于含有少量較大顆粒及粗纖維的培養(yǎng)基,可用粗濾的方法(不應(yīng)影響培養(yǎng)基質(zhì)量)予以除去,培養(yǎng)基結(jié)塊會造成培養(yǎng)基滅菌的不.

　　7、滅菌鍋內(nèi)空氣是否排凈

　　這個是影響滅菌是溫度和壓力比例關(guān)系的要點,同樣達到了相同的壓力的情況下,如果空氣未能排凈,也就是說不是純蒸汽滅菌,此時的溫度不一定能達到目的要求,會嚴重影響滅菌效果.

　　滅菌后的培養(yǎng)基存放時間和保存方式

　　1、瓊脂培養(yǎng)基的融化

　　將培養(yǎng)基放到沸水浴中或采用有相同效果的方法(如高壓鍋中的層流蒸汽)使之融化.經(jīng)過高壓的培養(yǎng)基應(yīng)盡量減少重新加熱時間,融化后避免過度加熱.融化后應(yīng)短暫置于室溫中(如2分鐘)以避免玻璃瓶破碎.

　　融化后的培養(yǎng)基放入47攝氏度至50攝氏度的恒溫水浴鍋中冷卻保溫(可根據(jù)實際培養(yǎng)基凝固溫度適當提高水浴鍋溫度),直至使用,培養(yǎng)基達到47攝氏度至50攝氏度的時間與培養(yǎng)基的品種、體積、數(shù)量有關(guān).融化后的培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用,放置時間一般不應(yīng)超過4h.未用完的培養(yǎng)基不能重新凝固留待下次使用.敏感的培養(yǎng)基尤應(yīng)注意,融化后保溫時間應(yīng)盡量縮短,如有特定要求可參考的標準傾注到樣品中的培養(yǎng)基溫度應(yīng)控制在約45攝氏度左右.

　　2、平板的制備和儲存

　　傾注融化的培養(yǎng)基到平皿中,使之在平皿中形成厚度至少為3毫米(直徑90毫米的平皿,通常要加入18毫升至20毫升瓊脂培養(yǎng)基).將平皿蓋好皿蓋后放到水平平面使瓊脂冷卻凝固.如果平板需儲存,或者培養(yǎng)時間超過48h或培養(yǎng)溫度高于40攝氏度,則需要傾注更多的培養(yǎng)基.凝固后的培養(yǎng)基應(yīng)立即使用或存放于暗處和(或)5攝氏度±3攝氏度冰箱的密封袋中,以防止培養(yǎng)基成分的改變.在平板底部或側(cè)邊做好標記,標記的內(nèi)容包括名稱、制備日期和(或)有效期.也可使用適宜的培養(yǎng)基編碼系統(tǒng)進行標記.

　　將倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延長儲存期限.為了避免冷凝水的產(chǎn)生,平板應(yīng)冷卻后再裝入袋中.儲存前不要對培養(yǎng)基表面進行干燥處理.

　　對于采用表面接種形式培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基,應(yīng)先對瓊脂表面進行干燥:揭開平皿蓋,將平板倒扣于烘箱或培養(yǎng)箱中(溫度設(shè)為25攝氏度至50攝氏度);或放在有對流的無菌凈化臺中,直到培養(yǎng)基表面的水滴消失為止.注意不要過度干燥.

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