實驗原理：酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)操作步驟

　　ELISA檢測系統(tǒng)可謂是免疫學(xué)反應(yīng)應(yīng)用到科研生產(chǎn)中為廣泛為靈敏的技術(shù)手段。下面古朵生物技術(shù)小編簡單介紹一下酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)操作步驟。詳細(xì)步驟如下：

　　1.用靶蛋白(稀釋于 50 mM 碳酸鹽緩沖液 PH 9.0)包被反應(yīng)板。濃度應(yīng)該做滴度來獲得。但對于純化的抗原在1μg/ml濃度，每孔 50 μl一般情況下足夠。用薄膜覆蓋4oC孵育過夜。

　　2.移去抗原溶液。加入封閉液200μl/孔(PBS containing 1% BSA and 0.02% azide)以封閉非特異蛋白的結(jié)合。室溫下卵育1–2小時，或4oC過夜。

　　3.移去封閉液。用PBS漂洗一次。濕潤的反應(yīng)板(孔)在密封塑料袋中4oC下可保存4周。使用移去多余液體。

　　4.加入用封閉液稀釋的檢測抗體和對照 50 μl/每孔?？贵w可以做一個系列稀釋以確定一個滴度或者用以曾經(jīng)用于篩選試驗的濃度，以及根據(jù)抗原含量滴度。室溫下孵育一小時。

　　5.用含0.05%Tween-20(Tween-20: sc-29113)PBS沖洗培養(yǎng)板3次。吸去多余的液體。

　　6.每孔加入50μl用封閉緩沖液稀釋 1:100-1:1000 倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗 ( WB 用常規(guī)二抗)抗體濃度應(yīng)通過滴度來獲得。室溫下孵育1小時。

　　7.移去孔內(nèi)液體。用含0.005%Twenn-20PBS沖洗3次并風(fēng)干。

　　8.用二乙醇胺緩沖液 (10 mM diethanolamine, 0.5 mM MgCl2 (pH 9.5) 沖洗培養(yǎng)孔并移去液體。

　　9.用二乙醇胺緩沖液(diethanolamine buffer)稀釋底物(PNPP, sc-3720)，終濃度為1mg/ml。每孔加入50μl。反應(yīng)10–20分鐘或陽性對照的405/490 吸光度約為1.0。加入50μl0.1MEDTA(EDTA: sc-29092)，PH 7.5。酶標(biāo)儀讀取405/490 nm 光吸收值。

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