古朵實(shí)驗(yàn)分享——ELISA實(shí)驗(yàn)顯性淡、靈敏度低怎么回事?

　　問(wèn)題序號(hào)可能原因解決方法

　　顯色淡，靈敏度偏低1 試劑盒未充分平衡試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開(kāi)盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫(約25℃)

　　2 樣品不適合做ELISA檢測(cè)樣品一般選擇培養(yǎng)上清、血清、血漿。其他樣品形式可能不適合做ELISA檢測(cè)或者需要優(yōu)化檢測(cè)的條件(例如稀釋液的成分)

　　3 酶標(biāo)板在貯存或洗后拍干時(shí)過(guò)分干燥防止板過(guò)于干燥

　　4 包被抗體遭到破壞操作溫和，移液槍不能碰到孔底

　　5 樣本和抗體孵育條件不合適按照說(shuō)明書(shū)條件，建議孵育過(guò)程中全程振蕩孵育。

　　6 洗滌浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)按照說(shuō)明書(shū)操作。勿人為增加浸泡時(shí)間;

　　7 偶聯(lián)HRP試劑污染棄去試劑，重新配置

　　8 錯(cuò)誤的稀釋偶聯(lián)HRP試劑棄去試劑，重新配置

　　9 TMB底物孵育時(shí)間過(guò)短，因非人為因素影響，需要優(yōu)化孵育時(shí)間確定合適的孵育時(shí)間：人為判定-gao濃度的標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)深藍(lán)色;S4-5有淡藍(lán)色;機(jī)器判定620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值達(dá)到0.6-0.65

　　10 樣本濃度過(guò)高或存在基質(zhì)效應(yīng)建議做不同稀釋倍數(shù)，確認(rèn)樣本jia稀釋倍數(shù)。

　　11 酶標(biāo)儀濾光片設(shè)置有問(wèn)題或者波長(zhǎng)選擇不對(duì)確認(rèn)儀器設(shè)置及選擇正確的波長(zhǎng)檢測(cè)。

　　12 酶標(biāo)板不適合做ELISA不能使用細(xì)胞培養(yǎng)板，建議使用ELISA高吸附力板子。

　　背景深，全部呈有色(通常的Elisa背景值OD<0.2)1 洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標(biāo)記物殘留洗液準(zhǔn)確配制;充分洗滌，靜置15秒，*拍干。加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用，否則易造成污染。

　　2 底物污染，未避光保存，出現(xiàn)顏色棄去底物，重新配置

　　3 樣品稀釋液污染棄去稀釋液，重新配置

　　4 吸頭重復(fù)使用，未洗凈或消毒不*吸頭盡可能一次性使用

　　5 不正確的孵育時(shí)間，溫度(尤其是底物孵育的時(shí)間)wei常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。*按照說(shuō)明書(shū)要求。

　　6 偶聯(lián)抗體(streptavidin-HRP)濃度過(guò)高按照說(shuō)明書(shū)調(diào)整到j(luò)ia的濃度

　　7 ELISA板子不正確的貯存酶標(biāo)板貯存于2-8 ℃;使用結(jié)合力低點(diǎn)的Elisa板

　　8 沒(méi)有正確封閉在標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中加入動(dòng)物蛋白或延長(zhǎng)封閉時(shí)間

　　9 樣本溶血嚴(yán)重建議使用非溶血或輕微溶血樣本，嚴(yán)重溶血樣本會(huì)導(dǎo)致背景偏高。

　　重復(fù)性不佳，高CV值1 樣品不均一加樣前充分混勻樣品，取樣確保移液位置一致;

　　2 包被板表面遭到破壞洗板加樣時(shí)盡量小心，避免破壞板的包被表面

　　3 孔與孔之間的交叉污染孵育后取下蓋子小心操作，避免孔與孔的污染;封板膜不能重復(fù)使用

　　4 加樣量不一致樣品稀釋前應(yīng)充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴

　　5 邊緣效應(yīng)(外周孔顯色較中心孔深)孵育時(shí)盡量100 rpm旋轉(zhuǎn)混勻

　　6 微量加樣不準(zhǔn)確保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性

　　7 不正確的洗滌洗液準(zhǔn)確配制;充分洗滌，靜置15秒，確定每一步的洗滌

　　出現(xiàn)白板，陽(yáng)性對(duì)照不顯色1 顯色液變質(zhì)更換新的顯色液

　　2 洗滌液配制有誤請(qǐng)按說(shuō)明書(shū)所示稀釋倍數(shù)配制

　　3 未加酶結(jié)合物而認(rèn)為已加入注意不要漏加

　　4 終止液誤作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜镆菏褂妹看渭右呵熬鶓?yīng)看清標(biāo)簽

　　5 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法錯(cuò)誤/或標(biāo)準(zhǔn)品有問(wèn)題請(qǐng)按照說(shuō)明書(shū)所示配置說(shuō)明書(shū)，注意單位和稀釋倍數(shù)

　　6 不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑混用建議使用同批次試劑盒。不能混用不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑。

　　不正常的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)1 錯(cuò)誤的方法重懸標(biāo)準(zhǔn)品 加入正確量的溶液重懸標(biāo)準(zhǔn)品，重懸充分

　　2 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋錯(cuò)誤 按照說(shuō)明書(shū)要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)品

　　3 標(biāo)準(zhǔn)品污染 使用一次性的滅菌吸頭， 標(biāo)準(zhǔn)品貯存于2-8 ℃

　　4 錯(cuò)誤的倍比稀釋步驟 按照說(shuō)明書(shū)倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品

　　5 波長(zhǎng)選擇錯(cuò)誤TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而 前者比色波長(zhǎng)為450nm，后者為492nm。雙波長(zhǎng)比色分析優(yōu)于單波長(zhǎng)。

　　6 標(biāo)準(zhǔn)品混用 不同批號(hào)試劑勿混用

　　7 試劑盒在運(yùn)輸途中時(shí)間太長(zhǎng)，溫度太高，標(biāo)準(zhǔn)品失活 盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間，夏季應(yīng)放冰塊降溫

　　8 ELISA未終止而直接檢測(cè)450nm和620nmTMB顯色需終止后檢測(cè)，否則會(huì)出現(xiàn)620nm比450nm讀數(shù)高的現(xiàn)象。(數(shù)值仍有梯度規(guī)律)

　　樣品或標(biāo)準(zhǔn)品OD超出正常范圍1 錯(cuò)誤的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋 *按照說(shuō)明書(shū)稀釋

　　2 偶聯(lián)抗體濃度過(guò)高 按照說(shuō)明書(shū)調(diào)整到j(luò)ia的濃度

　　3 TMB底物孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 調(diào)整到合適的孵育時(shí)間

　　4 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品污染 避免污染

　　5 錯(cuò)誤的孵育時(shí)間或溫度 *按照說(shuō)明書(shū)

　　6 孵育時(shí)未加蓋導(dǎo)致溶液揮發(fā)和污染 貼封片或加蓋

　　標(biāo)曲很好，但是樣本無(wú)法計(jì)算到數(shù)值1 標(biāo)曲選擇不合適選擇合適的標(biāo)曲擬合;

　　2 樣本含量很低，低于靈敏度無(wú)法被檢測(cè)到嘗試濃縮樣本或使用高敏ELISA試劑盒檢測(cè)

　　3樣本含量很高，超過(guò)標(biāo)曲建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索稀釋倍數(shù)，確保樣本OD值落在標(biāo)曲范圍內(nèi)

　　標(biāo)曲高濃度間無(wú)明顯趨勢(shì)1如OD值靠譜，但是僅無(wú)梯度，則顯色過(guò)度TMB顯色體系中建議根據(jù)S1，S2顏色進(jìn)行判斷，當(dāng)S1，S2深藍(lán)色，有明顯梯度，S5有淡藍(lán)色時(shí)即可終止。

　　2僅作單波長(zhǎng)檢測(cè)。由于參考波長(zhǎng)讀取非特異性檢測(cè)，如指紋、劃痕、水漬等，對(duì)結(jié)果也有影響。建議終結(jié)果以雙波長(zhǎng)為準(zhǔn)確。

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