半定量RT-PCR的實(shí)驗(yàn)原理和方法步驟

　　RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對(duì)表達(dá)信息進(jìn)行檢測(cè)或定量。另外，這項(xiàng)技術(shù)還可以用來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫(kù)克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。

　　RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性的引物(GSP)起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在*條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行。

　　實(shí)驗(yàn)步驟：

　　Trizol法RNA提取步驟

　　1、提取總RNA

　　2、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

　　3、PCR反應(yīng)

　　以下實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考：

　　1 樣品RNA的抽提

　　①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。

　?、趦上喾蛛x

　　每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lv仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lv仿相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。

　?、跼NA沉淀

　　將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積yi丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm

　　離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

　?、躌NA清洗

　　移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀?；靹蚝螅?℃下7000rpm離心5分鐘。

　?、軷NA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

　?、奕芙釸NA沉淀

　　溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

　　2 RNA質(zhì)量檢測(cè)

　　1)紫外吸收法測(cè)定

　　先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液

　　濃度和純度。

　　① 濃度測(cè)定

　　A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40

　　μg/ml。具體計(jì)算如下：

　　RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測(cè)得A260=0.21

　　RNA 濃度=0.21 ×100 ×40 μg/ml=840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

　　取5ul用來(lái)測(cè)量以后，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為：

　　35 μl × 0.84 μg/μl=29.4 μg

　?、诩兌葯z測(cè)

　　RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

　　2)變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定

　?、僦颇z

　　1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲quan溶液(12.3

　　M)。

　　10×MOPS電泳緩沖液

　　濃度 成分

　　0.4M MOPS，pH 7.0

　　0.1M 乙酸鈉

　　0.01M EDTA

　　灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25

　　μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。

　?、跍?zhǔn)備RNA樣品

　　取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

　?、垭娪?/p>

　　上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2–3cm。

　　④紫外透射光下觀察并拍照

　　28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類(lèi)型)，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過(guò)程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。

　　3樣品cDNA合成

　　①反應(yīng)體系

　　序號(hào) 反應(yīng)物 劑量

　　1 逆轉(zhuǎn)錄buffer 2μl

　　2 上游引物 0.2μl

　　3 下游引物 0.2μl

　　4 dNTP 0.1μl

　　5 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5μl

　　6 DEPC水 5μl

　　7 RNA模版 2μl

　　8 總體積 10μl

　　輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

　　②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV

　　之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。

　　③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。

　　4梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的管家基因(β-actin)實(shí)時(shí)定量PCR

　?、佴?actin陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備

　　陽(yáng)性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋(加水27μl并充分混勻)為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。

　　②反應(yīng)體系如下：

　　標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系

　　序號(hào) 反應(yīng)物 劑量

　　1 SYBR Green 1 染料 10μl

　　2 陽(yáng)性模板上游引物F 0.5μl

　　3 陽(yáng)性模板下游引物R 0.5μl

　　4 dNTP 0.5μl

　　5 Taq酶 1μl

　　6 陽(yáng)性模板DNA 5μl

　　7 ddH2O 32.5μl

　　8 總體積 50μl

　　輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

　　管家基因反應(yīng)體系：

　　序號(hào) 反應(yīng)物 劑量

　　1 SYBR Green 1 染料 10μl

　　2 內(nèi)參照上游引物F 0.5μl

　　3 內(nèi)參照下游引物R 0.5μl

　　4 dNTP 0.5μl

　　5 Taq酶 1μl

　　6 待測(cè)樣品cDNA 5μl

　　7 ddH2O 32.5μl

　　8 總體積 50μl

　　輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

　?、壑苽浜玫年?yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃ 2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。

　　5 制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板

　?、籴槍?duì)每一需要測(cè)量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

　　反應(yīng)體系：

　　序號(hào) 反應(yīng)物 劑量

　　1 10×PCR緩沖液 2.5 ul

　　2 MgCl2溶液 1.5 ul

　　3 上游引物F 0.5ul

　　4 下游引物R 0.5ul

　　5 dNTP混合液 3ul

　　6 Taq聚合酶 1ul

　　7 cDNA 1ul

　　8 加水至總體積為 25ul

　　輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

　　35個(gè)PCR循環(huán)(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72oC延伸5分鐘。

　　②PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

　　③將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋:

　　設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個(gè)濃度梯度。

　　6 待測(cè)樣品的待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR

　?、偎衏DNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系。

　　體系配置如下：序號(hào) 反應(yīng)物 劑量

　　1 SYBR Green 1 染料 10 ul

　　2 上游引物 1ul

　　3 下游引物 1ul

　　4 dNTP 1ul

　　5 Taq聚合酶 2ul

　　6 待測(cè)樣品cDNA 5ul

　　7 ddH2O 30ul

　　8 總體積 50ul

　　輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

　?、趯⑴渲坪玫腜CR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃2分鐘預(yù)變性，然后按93℃

　　1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個(gè)循環(huán)，后72℃7分鐘延伸。7 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表

　　引物設(shè)計(jì)軟件：Primer Premier

　　5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ);引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu);引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。

　　上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專(zhuān)門(mén)從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷(xiāo)售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷(xiāo)多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營(yíng)宗旨;牢固樹(shù)立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向，不斷開(kāi)發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。