古朵帶您了解、蛋白純化方法的選擇

　　蛋白純化的目的是將目標(biāo)蛋白質(zhì)從細(xì)胞裂解液的全部組分中分離出來，同時(shí)仍保留蛋白的生物學(xué)活性及化學(xué)完整性。蛋白質(zhì)的分離和提純工作是一項(xiàng)艱巨而繁重的任務(wù)，需根據(jù)蛋白的特性選擇合適的純化方法來提高獲得的蛋白制品的純度。

　　蛋白純化方法

　　蛋白純化的原理為：不同蛋白質(zhì)的氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致其在物理、化學(xué)、生物學(xué)等性質(zhì)上存在差異，利用待分離蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)性質(zhì)上的差異，即可以設(shè)計(jì)出一套合理的蛋白純化方案。蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細(xì)純化階段兩個階段。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細(xì)胞成分如RNA、DNA等分開，常用的方法為硫酸銨沉淀法。精細(xì)純化階段的目的是把目的蛋白與其他大小及理化性質(zhì)接近的蛋白區(qū)分開來，常用的方法有：凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析、親和層析等。

　　凝膠過濾層析

　　凝膠過濾(也叫排阻層析或分子篩)是一種根據(jù)分子大小從混合物中分離蛋白質(zhì)的方法。不同蛋白的形狀及分子大小存在差異，在混合物通過含有填充顆粒的凝膠過濾層析柱時(shí)，由于各種蛋白的分子大小不同，擴(kuò)散進(jìn)入特定大小孔徑顆粒內(nèi)的能力也各異，大的蛋白分子會被先洗脫出來，分子越小，越晚洗脫，從而達(dá)到分離蛋白的目的。一般來說，凝膠過濾層析柱越細(xì)、越長純化的效果越好。凝膠過濾層析詳細(xì)介紹凝膠過濾層析所能純化的蛋白分子量范圍很寬，純化過程中也不需要能引起蛋白變性的有機(jī)溶劑。缺點(diǎn)是所用樹脂有輕度的親水性，電荷密度較高的蛋白容易吸附在上面，不適宜純化電荷密度較高的蛋白。

　　離子交換層析

　　離子交換層析是一種依據(jù)蛋白表面所帶電荷量不同進(jìn)行蛋白分離純化的技術(shù)。蛋白表面通常會帶有一定的電荷，電荷的氨基酸殘基均勻地分布在蛋白質(zhì)的表面，在一定條件下可以與陽離子交換柱或陰離子交換柱結(jié)合。這種帶電分子與固定相之間的結(jié)合作用是可逆的，在改變pH或者用逐漸增加離子強(qiáng)度的緩沖液洗脫時(shí)，離子交換劑上結(jié)合的物質(zhì)可與洗脫液中的離子發(fā)生交換而被洗脫到溶液中。由于不同物質(zhì)的電荷不同，其與離子交換劑的結(jié)合能力也不同，所以被洗脫到溶液中的順序也不同，從而達(dá)到分離的效果。離子交換色譜的基本原理及實(shí)驗(yàn)操作.

　　親和層析

　　親和層析純化是利用生物大分子物質(zhì)具有與某些相應(yīng)的分子專一性可逆結(jié)合的特性進(jìn)行蛋白純化的技術(shù)。該方法適用于從成分復(fù)雜且雜質(zhì)含量遠(yuǎn)大于目標(biāo)物的混合中提純目標(biāo)物，具有分離效果好、分離條件溫和、結(jié)合效率高、分離速度快的優(yōu)點(diǎn)。親和層析技術(shù)可以利用配基與生物分子間的特異性吸附來分離蛋白，也可以在蛋白上加入標(biāo)簽，利用標(biāo)簽與配基之間的特異性結(jié)合來純化蛋白。配基與生物分子之間的特異性吸附.

　　配基：在親和層析中起可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)稱為配基。配基可以是酶的底物、抑制劑、輔因子、特異性的抗體等。親和層析是根據(jù)固定相的配基與生物分子之間的親和能力不同來進(jìn)行相互分離的。依據(jù)選擇性的高低親和層析可以分為基團(tuán)性親和層析及高選擇性(專一性)親和層析?；鶊F(tuán)親和層析一種配基可以吸附多種蛋白，如以三嗪染料為配基純化含有糖基的一類蛋白質(zhì)或糖蛋白，高選擇性親和層析一種配基只能吸附一種蛋白，如單克隆抗體對抗原的特異性的吸附。

　　標(biāo)簽純化

　　利用基因工程技術(shù)在蛋白的氨基端或羧基端加入少許幾個額外氨基酸，這個加入的標(biāo)記可用來作為一個有效的純化依據(jù)。蛋白純化標(biāo)簽選擇GST標(biāo)簽純化：在蛋白質(zhì)序列中加入谷胱gan肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)，然后利用GlutathioneSepharose4B作親和純化，再利用凝xue酶或因子Xa切開。His標(biāo)簽純化：組an酸標(biāo)記(His-tag)是最通行的標(biāo)記之一，在蛋白質(zhì)的氨基端加上6~10個組an酸，在一般或變性條件(如8M尿素)下借助它能與Ni2+螯合柱緊緊結(jié)合的能力，用咪唑洗脫，或?qū)H降至5.9使組an酸充分質(zhì)子化，不再與結(jié)合Ni2+使之得以純化。His標(biāo)簽純化介紹

　　疏水作用層析

　　疏水作用層析是利用鹽-水體系中樣品分子的疏水基團(tuán)和層析介質(zhì)的疏水配基之間疏水力的不同而進(jìn)行分離的一種層析方法。該法利用了蛋白的疏水性，蛋白經(jīng)變性處理或處于高鹽環(huán)境下疏水殘基會暴露于蛋白表面，不同蛋白疏水殘基與固定相的疏水性配體之間的作用強(qiáng)弱不同，依次用從高至低離子強(qiáng)度洗脫液可將疏水用作由弱至強(qiáng)的組分分離。

　　疏水作用層析實(shí)驗(yàn)操作成本低且純化得到的蛋白具有生物學(xué)活性，是一種通用型的分離和純化蛋白質(zhì)的方法。該實(shí)驗(yàn)遵循“高鹽上樣，低鹽洗脫"的原則：高濃度鹽水溶液中蛋白質(zhì)在柱上保留，在低鹽或水溶液中蛋白質(zhì)從柱上被洗脫，特別適用于濃硫酸銨溶液沉淀分離后的母液以及該沉淀用鹽溶解后的含有目標(biāo)產(chǎn)品的溶液直接進(jìn)樣到柱上，當(dāng)然也適用7mol/鹽酸胍或8mol/L脲的大腸桿菌表達(dá)蛋白提取液直接進(jìn)樣到柱上，在分離的同時(shí)也進(jìn)行了復(fù)性。

　　其他純化方法

　　對于具有特殊性質(zhì)的蛋白，可以利用特殊的方法對其進(jìn)行純化，下面就一些蛋白的特殊性質(zhì)及純化方法做一介紹?？赡嫘跃喓希涸谀承┤芤簵l件下，有一些酶能聚合成二聚體、四聚體等，而在另一種條件下則形成單體，如相繼在這兩種不同的條件下按大小就可以進(jìn)行分級分離。熱穩(wěn)定性：大多數(shù)蛋白質(zhì)加熱到95℃時(shí)會解折疊或沉淀，利用這一性質(zhì)，可容易地將一種經(jīng)這樣加熱后仍保持其可溶性活性的蛋白質(zhì)從大部分其它細(xì)胞蛋白質(zhì)中分離開。蛋白酶解穩(wěn)定性：用蛋白酶處理上清液消化雜蛋白，可以純化得到具有蛋白酶解抗性的蛋白質(zhì)。溶解度：影響蛋白質(zhì)溶解度的外界因素很多，如溶液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度等。在特定的外界條件下，不同的蛋白質(zhì)具有不同的溶解度。適當(dāng)改變外界條件，控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度從而將其從溶液中析出。