免疫熒光技術(shù)操作步驟

　　基本原理

　　將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少，相對使用標記抗體用量偏大。

　　試劑與儀器

　　磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)：0.01mol/L，pH7.4

　　熒光標記的抗體溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 進行稀釋

　　緩沖甘油：分析純無熒光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩沖液 1 份配制搪瓷桶三只(內(nèi)有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml)有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊)熒光顯微鏡玻片架濾紙37℃溫箱等。

　　實驗步驟

　　1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待檢標本片上，10min后棄去，使標本保持一定濕度。

　　2. 滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液，使其*覆蓋標本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一30min定時間(參考：30min)。

　　3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 沖洗后，再按順序過 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不時振蕩。

　　4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。

　　5. 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度，一般可用“+"表示：(-)無熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱，但清楚可見;(++)熒光明亮;(+++--++++)熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++"以上，而各種對照顯示為(±)或(-)，即可判定為陽性。

　　古朵詳談免疫熒光技術(shù)注意事項

　　1. 對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋在 1：20-100 之間，要自行摸索-佳梯度，建立-好的稀釋比例，抗體濃度過低，會導致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。

　　2. 染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從 10 min 到數(shù)小時，一般 30 min 已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右)，高于 37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用 0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較 37℃30 min 效果好的多。

　　3. 為了保證熒光染色的正確性，*試驗時需設置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。

　　(1)標本自發(fā)熒光對照：標本加 1-2 滴 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS。

　　(2)特異性對照(抑制試驗)：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。

　　如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光， 待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。

　　4. 一般標本在高壓汞燈下照射超過 3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標本-好在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。

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