血清白蛋白和球蛋白的分析測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟@古朵技術(shù)

　　【目的與原理]】

　　掌握血清白蛋白和球蛋白測(cè)定的原理和方法，并用鹽析法測(cè)定水產(chǎn)動(dòng)物血清中白蛋白和球蛋白的含量。

　　血清中含有多種不同成分的蛋白質(zhì)，主要為白蛋白和球蛋白。用鹽析法沉淀血清中球蛋白，用雙縮脲法測(cè)定上清液中白蛋白，同時(shí)測(cè)定血清總蛋白。血清球蛋白的量從兩者的差值求得。

　　【[試劑與器材】

　　試劑：

　　1、球蛋白沉淀劑：稱取硫酸鈉(Na2SO4)208g，及亞硫酸鈉(Na2SO3)70g，加入蒸餾水約900ml，并加入濃硫酸2ml，使蒸餾水酸化。不停攪拌，待溶解后將溶液移入1L容量瓶?jī)?nèi)，用蒸餾水稀釋至1L刻度。保存于25℃以上的溫度中。

　　2、雙縮脲試劑

　　3、標(biāo)準(zhǔn)血清：市售或配制。

　　4、乙mi

　　器材：

　　可見(jiàn)分光光度計(jì)，離心機(jī)，試管若干及試管架，旋渦混合器，塑料試劑瓶，1L容量瓶，燒杯2個(gè)，吸管若干支，濾紙，擦鏡紙。

　　【實(shí)驗(yàn)步驟】

　　1、準(zhǔn)確吸取血清樣本0.2ml，置于10×100mm試管內(nèi)。以5ml刻度吸管加入球蛋白沉淀劑3.8ml，塞住管口，反復(fù)倒轉(zhuǎn)混和10次(不宜過(guò)多)。以1ml刻度吸管吸取懸液1ml(相當(dāng)于血清0.05ml)，置于另一試管內(nèi)，作為“總蛋白測(cè)定管"。剩余的混懸液另加乙mi約2ml，撳住管口，在約20秒鐘內(nèi)顛倒混和40次，然后經(jīng)每分鐘2500轉(zhuǎn)的速度離心沉淀5分鐘。此時(shí)試管內(nèi)分成三層：上層為乙mi，中層為球蛋白，下層為澄清的白蛋白溶液。將試管斜置在桌面片刻或輕擊試管，待蛋白塊自管壁分離后，將1ml吸管插入白蛋白溶液中并吸取此溶液1ml(小心，準(zhǔn)確，且不可觸及球蛋白塊片)。取出吸管，用濾紙拭去管尖可能附著的球蛋白沉淀，將白蛋白溶液加入另一試管內(nèi)，作為“白蛋白測(cè)定管"。在另一試管內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)血清0.2ml及球蛋白沉淀劑3.8ml，混和后準(zhǔn)確吸取混懸液1ml，加入一試管中作為“標(biāo)準(zhǔn)管"。再取一試管加球蛋白沉淀1ml，作為“空白管"。

　　2、每管中各加入雙縮脲試劑4毫升，充分混和后置室溫暗處30分鐘，用540nm或綠色濾光片進(jìn)行比色，以空白管校正光密度到0點(diǎn)，讀取各管光密度讀數(shù)。

　　3、計(jì)算

　　將所測(cè)得的光密度讀數(shù)按下列公式計(jì)算出白、球蛋白含量及其比值：

　　(1)總蛋白測(cè)定管光密度/ 標(biāo)準(zhǔn)管光密度×標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白濃度(g/100ml)=血清總蛋白g/100ml

　　(2)白蛋白測(cè)定管光密度/標(biāo)準(zhǔn)管光密度×標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白濃度(g/100ml)=血清白蛋白g/100ml

　　(3)血清總蛋白—血清白蛋白=血清球蛋白g/100ml

　　(4)血清白蛋白÷血清球蛋白=血清白蛋白、球蛋白比值(A/G)

　　4、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：同血清(漿)總蛋白測(cè)定雙縮脲法

　　但用球蛋白沉淀劑代替生理鹽水作為標(biāo)準(zhǔn)血清的稀釋劑。

　　【方法評(píng)估】

　　本方法采用鹽析法定量測(cè)定白蛋白和球蛋白的，用硫酸鈉和亞硫酸鈉分離血清白、球蛋白，所得結(jié)果與電泳法相符合。但由于鹽類濃度較高，操作需在較高的溫度下進(jìn)行，否則將有結(jié)晶析出。在25℃操作時(shí)，無(wú)結(jié)晶析出。用亞硫酸鈉作為沉淀劑除可在較低的溫度操作外，還有另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即它具有緩沖作用。亞硫酸鈉溶液呈堿性，其pH值高于所有血清蛋白的等電點(diǎn)，使各蛋白質(zhì)均帶有相同的電荷，這將有利于它們的分離。血清經(jīng)鹽析分離后，蛋白質(zhì)的測(cè)定一般均用比色法。

　　【應(yīng)用意義】

　　白蛋白和球蛋白的量是按魚種不同而有所變化，一些魚白蛋白>球蛋白，另一些魚白蛋白<球蛋白，白蛋白與球蛋白的成分按性別、年齡、成長(zhǎng)、季節(jié)的變化，營(yíng)養(yǎng)不良、饑餓、應(yīng)激刺激等所發(fā)生變化。

　　【注意事項(xiàng)】

　　1、某些用乙mi及離心沉淀不易得到白蛋白澄清液的標(biāo)本，在加入球蛋白沉淀劑后，可不加乙mi，而用優(yōu)質(zhì)小張中速濾紙?jiān)?7℃水浴箱中反復(fù)過(guò)濾多次，最后可獲得澄清液作白蛋白測(cè)定，必要時(shí)可按1：20比例擴(kuò)大血清及球蛋白沉淀劑用量。

　　2、本法測(cè)定結(jié)果與電泳法相符合，但操作須在25℃以上的室溫中進(jìn)行。如受實(shí)驗(yàn)室條件限制，只能在較低的溫度下進(jìn)行測(cè)定時(shí)，可改用鹽濃度較低的球蛋白沉淀劑(其它試劑及操作方法均與本法相同)，但測(cè)定結(jié)果白蛋白值較本法略高。常用的低濃度球蛋白沉淀劑為23%硫酸鈉溶液(230g，加蒸餾水至1L)或21%亞硫酸鈉溶液(無(wú)水亞硫酸鈉210g，加蒸餾水到1L)。

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