古朵生物ELISA常用檢測法—競爭法原理介紹

　　做ELISA實驗，有幾種常見的實驗方法，他們分別是競爭法、捕獲法、間接法、夾心法、而夾心法又可以分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法！在今天的文章中，古朵生物將詳細得跟大家講述競爭法的實驗原理！

　　競爭法一般分為直接競爭法和間接競爭法，這里我們以直接競爭法為例進行原理講解。直接競爭法，其基本原理是：將合適濃度的包被抗體包被于微孔板中，加入無關蛋白載體封閉未結(jié)合位點，加入標準品（樣本）和生物su標記的抗原物質(zhì)進行競爭結(jié)合，經(jīng)合適的溫度和一定時間的孵育，洗滌后，加入HRP標記的鏈霉親和素進行反應，TMB顯色，微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈負相關。

　　該方法一般用來檢測具有較少表位的小分子物質(zhì)，當然，這種方法也可以用來檢測大分子抗原物質(zhì)甚至是抗體。檢測大分子抗原物質(zhì)時，由于空間位阻的影響，使得該檢測方法沒有雙抗體夾心法檢測大分子抗原物質(zhì)靈敏度高。這種方法在檢測抗體時，可能由于兩種競爭的抗體來源不一，導致兩種抗體趨同性不高，就使得檢測結(jié)果的可靠性不高。

　　當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺于陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標本和酶標抗體進行競爭結(jié)合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結(jié)合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結(jié)合，洗滌后再加入酶標抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應?？笻Be的檢測一般采用此法。

　　ELISA實驗步驟

　　以稀釋液將待檢標本做適當稀釋（預試中確定）加入包被有已知抗原的酶標板中（50ul/孔），加封口膠帶于37℃作用30min。

　　2.棄反應液，以沖洗液連續(xù)洗板5次并于吸水紙上拍干。

　　3.加入酶標抗體（濃度在預試中確定）。加封口膠帶后于37℃作用30min。

　　4.重復第2步。

　　5.加底物（濃度在預試中確定），加封口膠帶后于室溫下避光作用5-60 min，其間不時觀察，顯色滿意后加終止液50ul/孔。

　　6.于酶標儀測定OD值，OPD用492nm測定，TMB用450nm測定。

　　ELISA實驗注意事項

　　每次實驗均應做陰性對照、陽性對照及空白對照（以PBS代替標本），后者為本底值，在分析實驗結(jié)果時應扣除本底值，陽性對照<陰性對照<空白對照實驗成立。

　　2.一般認為小分子抗原宜用本法檢測，而大分子抗原則宜采用夾心法檢測，但具體宜采用哪種方法應根據(jù)試驗決定，本發(fā)與夾心法相比在操作上減少一步。包被抗體與酶標抗體如果分別采用單克隆抗體和多克隆抗體時，宜用單克隆抗體作為包被抗體，以多克隆抗體作為酶標抗體。

　　3.血清標本中抗原濃度一般較低，故一般用原倍標本進行檢測，必要時可進行稀釋測定，但應重新摸索酶標抗原的濃度，以確保方法的靈敏性。

　　4.以酶標記抗原的方法同酶標記抗體。

　　5.其它注意事項同酶聯(lián)免疫間接法。

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