凝膠過(guò)濾層析又稱凝膠排阻色譜, 分子篩色譜法, 凝膠過(guò)濾法等。利用凝膠過(guò)濾介質(zhì)為固定相，根據(jù)物料中溶質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的差異的液相色譜法。只依據(jù)尺寸大小分離，大組分最先被洗提出。色譜固定相是多孔性凝膠，只有直徑小于孔徑的組分可以進(jìn)入凝膠孔道。大組分不能進(jìn)入凝膠孔洞而被排阻，只能沿著凝膠粒子之間的空隙通過(guò)，因而最大的組分最先被洗提出來(lái)。小組分可進(jìn)入大部分凝膠孔洞，在色譜柱中滯留時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)更慢被洗提出來(lái)。溶劑分子因體積最小，可進(jìn)入所有凝膠孔洞，因而是最后從色譜柱中洗提出。這也是與其他色譜法最大的不同。
 

       凝膠過(guò)濾層析常見問題解答：

 

　　1. 色譜峰對(duì)稱性差
 

　　出峰上升時(shí)，上升緩慢是填料裝填過(guò)緊，而拖尾是因?yàn)檠b填的太松，此時(shí)對(duì)稱因子及柱效都很差，出現(xiàn)這種情況就要重現(xiàn)裝柱。裝柱前要了解填料的壓縮系數(shù)(壓縮因子)如Focurose FF系列的填料的壓縮系數(shù)是1.15，且裝完后要測(cè)柱效。
 

　　2. 柱床有裂縫或干涸等塌柱現(xiàn)象
 

　　檢測(cè)管路及柱床體系是否有泄露或氣泡，必要時(shí)重現(xiàn)裝柱。
 

　　3. 分離度差
 

　　(1) 樣品和選擇的填料不匹配
 

　　待分離的樣品中目標(biāo)物質(zhì)和其它雜質(zhì)的分子量小于2倍且都在選擇的填料的排阻極限之外或者之內(nèi)。若樣品中目標(biāo)物質(zhì)的分子量和其它雜質(zhì)的分子量小于2倍時(shí)，建議嘗試其它方法分離，反之選擇凝膠過(guò)濾層析時(shí)，填料的選擇應(yīng)根據(jù)樣品中目標(biāo)分子的大小選擇最接-近(大或小都可以)目標(biāo)分子排阻極限的填料進(jìn)行分離。
 

　　(2) 柱床裝填的效果差
 

　　通過(guò)測(cè)柱效等方式確保柱床裝填的滿足凝膠過(guò)濾層析的過(guò)程。
 

　　(3) 上樣量過(guò)大
 

　　根據(jù)樣品中目標(biāo)物質(zhì)和雜質(zhì)的分子差異優(yōu)化上樣量，如脫鹽等樣品中目標(biāo)分子和雜質(zhì)的分子量大于50倍時(shí)，上樣量可以達(dá)到柱床體積的25%，最高不超過(guò)30%，若樣品中目標(biāo)分子和雜質(zhì)的分子量差異在2-5倍時(shí)，通常上樣量控制在柱床體積的5%以內(nèi)。
 

　　(4) 流速過(guò)快
 

　　凝膠過(guò)濾的過(guò)程流速不宜過(guò)快，降低流速在一定程度上可以提高分離度。
 

　　(5) 層析填料被污染或老化
 

　　隨著填料的使用，一些雜質(zhì)的積累會(huì)使層析填料的孔徑發(fā)生變化(如堵塞，非特異性吸附積累，微生物污染，破碎等)，導(dǎo)致其排阻能力發(fā)生偏差而影響分離度。此時(shí)可對(duì)填料進(jìn)行CIP清洗，若清洗后還不能達(dá)到分離要求，就要更換新的填料。
 

　　(6) 樣品自身的問題
 

　　樣品粘度過(guò)大也會(huì)導(dǎo)致分離度下降，粘度大的樣品在凝膠過(guò)濾時(shí)要對(duì)其進(jìn)行稀釋處理在凝膠過(guò)濾；
 

　　樣品中目標(biāo)物質(zhì)和其它雜質(zhì)的非特異性結(jié)合或者作用力，此時(shí)就要嘗試添加一些添加劑(如2%的Triton x-100,150mM NaCl等)，減少樣品中各組份之間的作用力；
 

　　樣品的pH，離子強(qiáng)度對(duì)某些填料的柱床體積會(huì)產(chǎn)生一些影響，也會(huì)影響分離度，必要時(shí)可以優(yōu)化樣品的緩沖液。
 

　　4、反壓大，液流慢
 

　　凝膠過(guò)濾層析柱的裝填應(yīng)控制在60-100cm，太低影響分離度，太高反壓增大。另外填料的清潔程度及樣品的粘度，pH，離子強(qiáng)度也會(huì)影響液流速度。