免疫共沉淀和親和層析共分離：
 

　　免疫共沉淀是證明蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的最直接最jing典和*的方法，如蛋白A能與B相互作用結(jié)合成異源二聚體，無論用抗A或抗B的抗體或與A或 B的親和物偶聯(lián)的agarose小珠都能把A和B沉淀下來。因此廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用研究。
 

　　常用的小珠：
 

　　GST-Agarose(不需要抗體)
 

　　ProteinA-Agarose(用時需加抗體)
 

　　基本方法：
 

　　1.表達(dá)蛋白質(zhì)A
 

　　2.蛋白質(zhì)A與親和小珠結(jié)合
 

　　3.用結(jié)合有蛋白質(zhì)A的親和小珠調(diào)取細(xì)胞破碎液中蛋白質(zhì)B
 

　　4.離心、洗滌親和小珠若干次
 

　　5.處理親和小珠使蛋白質(zhì)A、B解吸附(可以直接用SDS-PAGE上樣BUFFER煮)
 

　　酵母雙雜交系統(tǒng)
 

　　基本原理，以酵母S.cerevisiae的轉(zhuǎn)錄因子GAL4系統(tǒng)為例
 

　　GAL4有兩個結(jié)構(gòu)上互相分開，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。
 

　　N 端1-147aa與DNA結(jié)合(DNA binding domain,BD)。
 

　　C端768-881aa能激活轉(zhuǎn)錄(Activation Domain,AD)。
 

　　BD+AD—能激活GAL4效應(yīng)基因的上游激活序列(UAS)。
 

　　把N和C分開分別構(gòu)建成兩種表達(dá)質(zhì)粒。如把Gal4的N端和誘餌蛋白(研究的目標(biāo)蛋白A)融合表達(dá)，把細(xì)胞cDNA和C端融合表達(dá)，cDNA編碼的蛋白x如能和A互相作用,就能把Gal4N端C端和N端聯(lián)系在一起，就可以激活UAS下游的基因表達(dá)。
 

　　半乳糖苷酶(Laz)基因克隆到URA3的下游。
 

　　在x-Gal的存在下酵母菌落成藍(lán)色(Fields)
 

　　酵母GAL4基因缺失；GAL80基因缺失(GAL4的負(fù)調(diào)控因子)
 

　　方法略
 

　　假陽性多，因此還必須再用免疫共沉淀等直接證據(jù)證明
 

　　發(fā)展：哺乳動物雙雜交系統(tǒng)、二倍體雙雜交系統(tǒng)、酵母單雜交系統(tǒng)、細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)、酵母三雜交系統(tǒng)
 

　　FAR WESTERN
 

　　Western blot 是免疫印記，而Far western 是蛋白質(zhì)鋪蓋技術(shù)，兩者其實(shí)在本質(zhì)上是相似的，只是免疫印記是直接用抗體去檢測抗原，常用于蛋白質(zhì)定性；而Far western則是用標(biāo)記的蛋白(125I或熒光)去probe與之相互作用的蛋白，或再用抗這種蛋白的抗體顯示這種蛋白的結(jié)合位置，用于研究蛋白質(zhì)的相互作用。
 

　　基本步驟：
 

　　1.表達(dá)和提純獲得蛋白A，并作熒光或放射性標(biāo)記，或制備抗A抗體
 

　　2.細(xì)胞總蛋白SDS-PAGE(一起染色，另一塊轉(zhuǎn)膜)
 

　　3.電轉(zhuǎn)膜
 

　　4.封閉
 

　　5.加入蛋白A，如A帶標(biāo)記，洗膜后直接顯影；如未標(biāo)記，可加抗A抗體再加二抗或標(biāo)記的蛋白A。
 

　　優(yōu)點(diǎn)：簡單、經(jīng)濟(jì)
 

　　缺點(diǎn)：SDS-PAGE影響蛋白質(zhì)構(gòu)象，可能影響相互作用
 

　　表面等離子共振(SPR)法原理：SPR法是生物科學(xué)、物理學(xué)和計(jì)算科學(xué)結(jié)合的方法，在玻璃表面鍍上一層金薄膜，再把目標(biāo)蛋白通過氨基共價(jià)偶聯(lián)在金膜表面制成傳感芯片。當(dāng)一束偏振光照射到傳感芯片的金膜時會引起金屬中的電子共振，而導(dǎo)致反射光會在一定角度內(nèi)大大減弱，其中反射光*消失的角度稱為共振角。共振角會隨著金膜表面通過的液相的折射率的改變而改變，而折射率的改變又與結(jié)合在金膜表面的生物大分子的質(zhì)量成正比，每結(jié)合1ng/mm2折射率的變化相當(dāng)于1000RU(共振單位)，如果通過的液相中有能與膜表面偶聯(lián)的靶蛋白相互作用而結(jié)合的蛋白質(zhì)或其它化學(xué)物，就使結(jié)合在金膜表面的生物大分子質(zhì)量增加，檢測的共振單位(RU)也增加。通過光檢測單元檢測反射光的變化，經(jīng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)處理后，獲得實(shí)時傳感圖。
 

　　特點(diǎn)：
 

　　1.靈敏度，所需樣品少(20μl就可分析)
 

　　2.可以同時確定互相作用動力學(xué)參數(shù)Ka、Kd值3.可以測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用，也可測蛋白質(zhì)與共它分子互相作用(小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、寡聚糖、類脂、噬菌體、病毒和細(xì)胞)
 

　　3.可以回收結(jié)合的蛋白進(jìn)一步研究和鑒定(如質(zhì)譜分析)SPR分析的條件控制：樣品制備：樣品的PH、離子強(qiáng)度，對相互作用有顯著影響，一般PH范圍在6.8-7.8之間，低離子強(qiáng)度，樣品中蛋白質(zhì)濃度變化影響不大，樣品體積20-50μl。溫度：一般25℃+5℃，溫度高于30℃對相互作用有影響進(jìn)流速：全程流速恒定，進(jìn)樣速度不宜過快，保證接觸時間，一般進(jìn)樣速度 5-10μl/分。