實時熒光定量PCR(Real time PCR)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，并對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。其涉及領(lǐng)域包括：臨床疾病診斷、動物檢驗檢疫、食品安全和科學(xué)研究等。在xin型guan狀病毒、肝炎、艾zi病、流感、登革熱、感染性腹瀉等的檢測、診斷和治療上發(fā)揮著重要作用。
 

　　實時熒光定量PCR法可分別為SYBR Green l熒光染料法和Taqman探針法。日常進(jìn)行核酸檢測就是運用Taqman探針法，新guan病毒核酸檢測也是利用此項技術(shù)。該法高度特異，其核心是利用Taq酶的3’→5’外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。
 

　　在Taqman探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針的5’端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher，Q)，如TAMRA等。當(dāng)探針完整時，報告基團(tuán)所發(fā)射的熒光被淬滅基團(tuán)吸收，儀器不能檢測信號。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3’→5’外切核酸酶活性被探針切斷，報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，能量不能被吸收，就產(chǎn)生熒光信號。因此每經(jīng)過一個循環(huán)，熒光信號就和目的片段一樣有一個同步指數(shù)增長過程。
 

　　這里涉及基線和CT值的概念?；€是用來確定背景的熒光信號強(qiáng)度的參比對照，相當(dāng)于PCR指數(shù)擴(kuò)增期以前的熒光強(qiáng)度水平。CT值是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，其由擴(kuò)增反應(yīng)體系中模板的初始濃度決定。
 

　　與傳統(tǒng)PCR相比，實時熒光定量PCR有著以下優(yōu)點：
 

　　1.檢測結(jié)果既可以定性，也可以定量；
 

　　2.檢測靈敏度高；
 

　　3.無需進(jìn)行凝膠電泳實驗，節(jié)省實驗時間，提高了效率。
 

圖1 Taqman探針法工作原理
 

圖2 實時熒光定量PCR的幾個主要參數(shù)