理論知識(shí)點(diǎn)看了千千萬(wàn)，但是還是容易混淆概念傻傻分不清IP，Co-IP，GST-Pull Down，本文我們不止放送有IP與Co-IP區(qū)別知識(shí)要點(diǎn)，而且也將研究蛋白互作幾種方法(酵母雙雜交系統(tǒng)(Y2H)，CO-IP的關(guān)系，GST-Pull Down)之間的區(qū)別以及優(yōu)缺點(diǎn)簡(jiǎn)明扼要的收納進(jìn)來(lái)，看了這篇文章你還不能區(qū)分IP，Co-IP，GST-Pull Down你就來(lái)打我。話不多說(shuō)，看下文：
 

　　獨(dú)角戲——IP:
 

　　免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)就是用偶聯(lián)相應(yīng)抗體的磁珠把你要研究的蛋白X免疫沉淀下來(lái)，然后去檢測(cè)它。例如蛋白X在細(xì)胞內(nèi)的蛋白量不同，或者有著不同的翻譯后修飾，這時(shí)就可以用X蛋白抗體+Prorein A beads來(lái)進(jìn)行IP，從細(xì)胞中把蛋白X拉下，再用特異的抗體(如磷酸化，泛素化抗體)進(jìn)行WB來(lái)檢測(cè)蛋白X的變化。簡(jiǎn)言之，IP就是檢測(cè)單個(gè)蛋白的狀態(tài)(高矮胖瘦，有沒(méi)有戴帽子，穿的什么衣服等等)。
 

       眾里尋她千bai度——酵母雙雜交系統(tǒng)(Y2H)：

 

　　酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程的認(rèn)識(shí)。真核生物中基因轉(zhuǎn)錄需要轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子含有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain，DNA-BD)和DNA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activation domain，AD)，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可以獨(dú)立分開(kāi)，功能互不影響。BD和AD分別單獨(dú)作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，只有當(dāng)二者在空間上充分接近時(shí)，才呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄激活因子活性，使下游基因得到轉(zhuǎn)錄。根據(jù)這一原理，可設(shè)計(jì)酵母雙雜交系統(tǒng)。
 

　　將兩待研究蛋白(蛋白 X 與蛋白 Y)分別與 BD、AD 結(jié)構(gòu)域構(gòu)建融合質(zhì)粒。將構(gòu)建好的兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一酵母細(xì)胞中表達(dá)，如果兩蛋白之間不存在相互作用，則下游基因(報(bào)告基因)不會(huì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)；如果兩個(gè)蛋白間存在相互作用，則BD與AD兩結(jié)構(gòu)域空間上很接近，從而下游基因(報(bào)告基因)得以轉(zhuǎn)錄。通過(guò)報(bào)告基因表達(dá)與否，即可判斷兩蛋白之間是否存在相互作用。
 

　　通常在現(xiàn)實(shí)情況中，與蛋白X存在潛在互作可能的候選蛋白會(huì)有好幾種(Y，Z，A，B等)，這時(shí)我們就可以通過(guò)酵母雙雜交在體內(nèi)篩選與X有相互作用的蛋白Y。
 

       遇見(jiàn)愛(ài)情——Co-IP：

 

　　竟然我們?cè)隗w內(nèi)驗(yàn)證過(guò)，那么蛋白X和蛋白Y在體外是否也存在相互作用了？這個(gè)時(shí)候我們可以用到Co-IP了~
 

　　免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)的原理和IP是一樣的，當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用被保留了下來(lái)，假如細(xì)胞內(nèi)存在 XY 蛋白復(fù)合物，用 X(X也稱為誘餌蛋白)的抗體免疫沉淀 X，那么與X 在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì) Y(Y也稱為靶蛋白)也被沉淀下來(lái)。因此在細(xì)胞裂解液中加入 X 的抗體沉淀蛋白X，隨后利用蛋白印跡(western blot，WB)檢測(cè)沉淀中是否存在蛋白 Y，如果存在，則說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)存在XY蛋白復(fù)合物，即蛋白XY存在相互作用。(在體外驗(yàn)證X和Y之間有聯(lián)系)
 

　　在我們用酵母雙雜交和Co-IP雙保險(xiǎn)驗(yàn)證X和Y之間確實(shí)存在相互作用后，我們發(fā)現(xiàn)酵母雙雜交和Co-IP的結(jié)果都只能說(shuō)明X和Y之間有相互作用，但并不能確定這種相互作用是直接的還是間接的，這個(gè)時(shí)候存在兩種可能：
 

　　X與Y之間存在直接的相互作用(X和Y自由戀愛(ài)一見(jiàn)鐘情)
 

　　也就是說(shuō)也許是X與M相互作用，而Y也和M相互作用，這樣，用A的抗體可以把M拉下來(lái)，但同時(shí)M又把B也拉下來(lái)了(X和Y是通過(guò)他們共同的朋友M介紹才認(rèn)識(shí)然后在一起的)
 

　　要想準(zhǔn)確確定X和Y直接的作用到底是直接的還是間接的了，這個(gè)時(shí)候我們需要祭出我們大boss——GST-Pull Down實(shí)驗(yàn)~
 

　　GST-Pull Down：GST-Pull down實(shí)驗(yàn)是一個(gè)行之有效的驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗(yàn)技術(shù), 近年來(lái)越來(lái)越受到廣大學(xué)者的青睞。
 

　　原理：將靶蛋白和GST組成的融合蛋白固定在谷胱甘肽(GSH)親和樹(shù)脂上，作為與目的蛋白親和支撐物,充當(dāng)一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過(guò)柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白)，洗脫結(jié)合物后通過(guò)SDS-PAGE電泳分析，從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白，“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過(guò)細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得，此方法簡(jiǎn)單易行，操作方便。