克隆成功與否,除與連接方式以及載體選擇有關(guān)外，載體的處理也是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

為了提高連接效率，處理載體時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

(1)應(yīng)加入常用量5～10倍的內(nèi)切酶水解載體，以保證載體被*酶切；

(2)如用雙酶切割載體，則必須電泳回收載體片段，除去雙酶切所產(chǎn)生的小DNA片段；

(3)如粘端連接,單酶切處理過的載體必須用

堿性磷酸酶 (如牛小腸堿性磷酸酶，CIP)處理，防止載體自身環(huán)化。CIP可以水解掉DNA5末端的磷酸。對(duì)于3末端突出的DNA(如PstI水解，需用10倍于5末端突出DNA(如EcoRI,HindⅢ)的CIP進(jìn)行去磷酸化，以達(dá)到最少的載體自身環(huán)化。

去磷酸方法如下：

①DNA加入10倍去磷酸化緩沖液，5端突出的DNA，每100pmol 5磷酸基團(tuán)加入1個(gè)單位的CIP，37℃反應(yīng)30分鐘。平末端或3端突出的 DNA，每2pmol 5 磷酸基團(tuán)加1個(gè)單位CIP，37℃保溫15分鐘后，再加CIP，55℃反應(yīng)45分鐘(2μg 5kb的線性DNA約含14pmol左右的5磷酸基團(tuán))；

②加入SDS、EDTA(pH8.0)和蛋白酶K分別至終濃度05%、 5mmol/L和50μg/ml，混勻后56℃反應(yīng)30分鐘；或加EDTA(pH8.0)至終濃度為5mmol/L，65℃保溫1小時(shí)或75℃，10分鐘滅活CIP;

③冷卻至室溫后，加入等體積酚/氯仿、氯仿分別抽提一次;10 mmol/L ZnCl210 mmol/L MgCl2100 mmol/L Tris?HCl,pH8.0。