精-確的蛋白質(zhì)定量是蛋白質(zhì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)所必需的，這些實(shí)驗(yàn)涉及分子生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，生物化學(xué)，發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)的研究課題。依托不同的科學(xué)原理，目前已經(jīng)發(fā)展出多種不同的蛋白測(cè)定方法，科研工作者廣泛使用的方法比如紫外吸收法（UV），雙縮脲法，考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）、Folin-酚試劑法（Lowry）、BCA（Bicinchoninic Acid）法、凱氏定氮法等等，各有千秋。今天小編就BCA法，Bradford法，2種常見(jiàn)蛋白定量方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)以及BCA法實(shí)驗(yàn)操作步驟給大家做詳細(xì)介紹，看看哪一種方法能獲得你的支持？

BCA（Bicinchoninic Acid）法

1、原理：

BCA (bicinchonininc acid)與二價(jià)銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑，混合一起即成為蘋果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，一個(gè)Cu+螯合二個(gè)BCA分子，工作試劑由原來(lái)的蘋果綠形成紫色復(fù)合物，562nm處有蕞高的吸收值，可在540-595nm測(cè)定其吸收值，顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。

2、特點(diǎn)：

BCA蛋白質(zhì)測(cè)定方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，正常情況下可在45分鐘內(nèi)完成測(cè)定；且試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳。不方便的是這種方法需要提前制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

靈敏度：例如Abbkine的定量總蛋白的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法），線性標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為50-1000 ug/ml，靈敏度25ug/ ml，蕞低檢測(cè)蛋白量達(dá)到5ug。

優(yōu)點(diǎn)：BCA方法適用于表面活性劑存在下的蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)，可兼容高達(dá)5%的SDS，TritonX-100及Tween等。

缺點(diǎn)：由于BCA方法依靠銅離子進(jìn)行顯色反應(yīng)，如果溶液中含有與銅離子反應(yīng)的螯合劑比如EDTA或者還原性試劑比如DTT、TCEP和β-巰基乙醇等，結(jié)果將受到很大程度的影響。此外，BCA方法的檢測(cè)結(jié)果也會(huì)受到蛋白質(zhì)內(nèi)半胱氨酸，酪氨酸，色氨酸含量的影響。

3、實(shí)驗(yàn)所需儀器及試劑：

恒溫水浴鍋、可見(jiàn)光分光光度計(jì)、離心機(jī)、旋渦混合器、試管

4、實(shí)驗(yàn)操作：

標(biāo)準(zhǔn)液制備：梯度稀釋牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品。將8個(gè)EP管按照1到8進(jìn)行標(biāo)記，將BSA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成1mg/mL工作液，準(zhǔn)備濃度梯0，50，100，200，400，600，800，1000 ug/mL。

BCA工作液制備：將A液和B液搖晃混勻，按照A:B=50:1的比例配置BCA工作液，充分混勻。（BCA工作液室溫下24h內(nèi)穩(wěn)定，故現(xiàn)用現(xiàn)配）

加樣孵育：吸取20μL各個(gè)稀釋濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)蛋白質(zhì)樣品，加入96孔板底部或試管中，向孔/管中再加入200uL BCA工作液輕輕搖晃混勻。在37°C下孵育30min，冷卻至室溫。

測(cè)定：冷卻到室溫后，以空白為對(duì)照，測(cè)量樣品在562nm或該波長(zhǎng)附近的吸光值

將各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白質(zhì)樣品在562nm處的吸光值減去空白標(biāo)準(zhǔn)品在562nm處的平均吸光值。

5、濃度計(jì)算：

在excel表中輸入對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線值和蛋白樣品值，選定標(biāo)準(zhǔn)曲線的OD值和標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度。

考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）

1、原理：

Bradford法也稱作考馬斯亮藍(lán)法，是由Bradford于1976年建立的。該方法的原理是，帶負(fù)電的考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)中堿性氨基酸相互作用?？捡R斯亮藍(lán)G250（Coomassie brilliant blue G250），是一種甲基取代的三苯基甲烷，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的蕞大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由游離狀態(tài)下的棕紅色變?yōu)樗{(lán)色。并且在一定濃度范圍內(nèi)，穩(wěn)定的染料-蛋白復(fù)合物的OD值與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。通過(guò)分光光度計(jì)或者酶標(biāo)儀以標(biāo)準(zhǔn)品蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，隨后檢測(cè)目標(biāo)蛋白595nm波長(zhǎng)處的吸光值，即可換算出目標(biāo)蛋白濃度。

2、特點(diǎn)：

簡(jiǎn)單便捷：僅需一種反應(yīng)試劑即可完成檢測(cè)，操作十分便捷，完成一個(gè)樣品的測(cè)定只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性蕞hao，不用考慮時(shí)間的限制。

靈敏度：例如Abbkine的蛋白質(zhì)定量試劑盒（Bradford法），線性標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為50-1000 ug/ml，靈敏度25ug/ ml，蕞低檢測(cè)蛋白量達(dá)到5ug。反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量。

優(yōu)點(diǎn)： Bradford 法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，如：K+ 、Na+ 、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、EDTA、DTT、TCEP 和β-巰基乙醇等。

缺點(diǎn)：由于蛋白-染料穩(wěn)定復(fù)合物之間是分子間作用力，故Bradford法會(huì)受到表面活性劑如：去污劑、1N的NaOH 、SDS、Triton X-100，Tween 20等的干擾。除此之外，不同靶標(biāo)蛋白中堿性氨基酸（范德華力作用）以及芳香族氨基酸（疏水作用）含量不一，對(duì)考馬斯亮藍(lán)的結(jié)合能力差異較大；而且隨著蛋白濃度增加，線性關(guān)系會(huì)出現(xiàn)偏差。

注意：

由于高濃度洗滌劑會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性，必須確保樣品中的SDS的濃度低于1％，Triton X-100低于0.1％，Tween 20,60,80低于0.06％。

檢測(cè)蛋白濃度的考馬斯亮藍(lán)和染色PAGE膠的考馬斯亮藍(lán)不是同一種物質(zhì)，前者采用考馬斯亮藍(lán)G250，后者采用考馬斯亮藍(lán)R250，G250和R250分子基本骨架一樣，但是G250多了兩個(gè)甲基，與蛋白反應(yīng)迅速，染膠慢且脫色困難，故用于蛋白定量；R250與蛋白反應(yīng)較緩慢，染膠較快且易于洗脫，故用于PAGE膠染色。

通過(guò)以上兩種蛋白定量的方法的對(duì)比，我們可以發(fā)現(xiàn)對(duì)于BCA法和Bradford法，每一種方法都有自身的優(yōu)勢(shì)和缺陷，因此針對(duì)同一樣本采用不同的方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果也可能出現(xiàn)偏差。所以我們?cè)谑褂脮r(shí)，應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件挑選蕞合適的檢測(cè)方法，這樣實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)才會(huì)更可靠!