樣品制備原則

    樣品制備是雙向電泳中關(guān)鍵的一步，將直接影響2-DE結(jié)果好壞。目前并沒有一個(gè)通用的樣品制備方法，盡管處理方法多種多樣，但都遵循幾個(gè)基本的原則：1）盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的損失；2）減少對(duì)蛋白質(zhì)的人為修飾；3）破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質(zhì)處于*變性狀態(tài)。

    根據(jù)這一原則，樣品制備需要四種主要的試劑：離液劑(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性劑（sufactants），也稱去垢劑，如CHAPS與Zwittergent系列等雙性離子去垢劑；還原劑（reducing agents），-常用的是二硫蘇糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等。當(dāng)然，也可以選擇性的加入Tris-base,蛋白酶抑制劑以及核酸酶。

    樣品的來源不同，其裂解的緩沖液也各不相同。通過不同試劑的合理組合，以達(dá)到對(duì)樣品蛋白的大抽提。在對(duì)樣品蛋白質(zhì)提取的過程中，必須考慮到去除影響蛋白質(zhì)可溶性和2DE重復(fù)性的物質(zhì)，比如核酸、脂、多糖等大分子以及鹽類小分子。大分子的存在會(huì)阻塞凝膠孔徑，鹽濃度過高會(huì)降低等電聚焦的電壓，甚至?xí)p壞IPG膠條，這樣都會(huì)造成2-DE的失敗。樣品制備的失敗很難通過后續(xù)工作的完善或改進(jìn)獲得補(bǔ)償。

    核酸的去除可采用超聲或核酸酶處理，超聲處理應(yīng)控制好條件，并防止產(chǎn)生泡沫；而加入的外源核酸酶則會(huì)出現(xiàn)在終的2D膠上。脂類和多糖都可以通過超速離心除去。透析可以降低鹽濃度，但時(shí)間太長(zhǎng)；也可以采取凝膠過濾或沉淀/重懸法脫鹽，但會(huì)造成蛋白質(zhì)的部分損失。

    因此，樣品制備方法必須根據(jù)不同的樣品、所處的狀態(tài)以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵髞磉M(jìn)行選擇。目前有很多方法適于2-DE，如組織或細(xì)胞的總蛋白提取物、亞細(xì)胞組份或細(xì)胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亞組份蛋白（如磷酸化蛋白、采用親合純化凝集素結(jié)合蛋白等）。

    一、細(xì)胞樣品

    1. 細(xì)胞培養(yǎng)，加藥與處理。

    2. 胰酶消化貼壁細(xì)胞，PBS漂洗3次(1500ｇ，5min)，棄上清, 再次離心，去盡殘液（非常重要！）。如要比較細(xì)胞膜蛋白組的差別，-好用細(xì)胞刮收獲細(xì)胞。如用10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替PBS，可有效降低樣品的鹽濃度。

    加入5倍體積裂解液，混勻（或?qū)?×106細(xì)胞懸于60～100?l裂解液中）。

    3. 加50ug/ml RNase及200ug/ml Dnase，在4℃放置15分鐘。

    4. 15,000轉(zhuǎn)，4℃離心60分鐘（或40,000轉(zhuǎn)，4℃離心30分鐘）。

    5. 收集上清。

    6. 測(cè)定蛋白濃度(采用BioRad RC/DC protein assay kit)。

    7. 分裝樣品，凍存于－70℃。

    二、組織樣品

    1. 碾缽碾磨組織，碾至粉末狀。

    2. 將適量粉末狀組織轉(zhuǎn)移至勻漿器，加入適量裂解液，進(jìn)行勻漿。

    3. 加50ug/ml RNase及200ug/ml DNase，在4℃放置15分鐘。

    4. 15,000轉(zhuǎn)，4℃離心60分鐘（或40,000轉(zhuǎn)，4℃離心30分鐘）。

    5. 收集上清，測(cè)定蛋白濃度。

    6. 分裝樣品，凍存于－70℃。

    注意事項(xiàng)：

    1. 8 mmol/L PMSF必須在添加還原劑之前用，否則PMSF會(huì)失去活性。

    2. 40 mmol/L濃度以下的Tris可使有些蛋白酶在高pH值下失活。

    3. 細(xì)胞清洗――大多用PBS，若PBS殘留于細(xì)胞表面會(huì)造成膠上出現(xiàn)水平條紋，則可利用(10 mmol/L Tris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)來解決此問題。

    雙向電泳操作步驟

    水化上樣(被動(dòng)上樣)

    1. 從冰箱中取出IPG膠條，室溫放置10min。

    2. 沿水化盤槽的邊緣從左向右線性加入樣品，槽兩端各1cm左右不加樣，中間的樣品液一定要連貫.注意：不要產(chǎn)生氣泡，否則會(huì)影響膠條中蛋白質(zhì)的分布。

    3. 用鑷子輕輕撕去IPG膠條上的保護(hù)層。注意：堿性端較脆弱，應(yīng)小心操作。

    4. 將IPG膠條膠面朝下輕輕置于水化盤中樣品溶液上.注意:不要將樣品溶液弄到膠條背面,因?yàn)檫@些溶液不會(huì)被膠條吸收;還使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如產(chǎn)生了氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕走。

    5. 放置30~45min大部分樣品被膠條吸收，沿著膠條緩慢加入礦物油，每根膠條約3ml(17cm IPG)，防止膠條水化過程中液體蒸發(fā)。

    6. 置等電聚焦儀于-20℃水化11~15h。

    第1向 等電聚焦

    1. 將紙電極置于聚焦盤的正負(fù)極上，加ddH2O 5~8?l潤(rùn)濕。

    2. 取出水化好的膠條，提起一端將礦物油瀝干，膠面朝下，將其置于剛好潤(rùn)濕的濾紙片上雜交以去除表面上的不溶物。

    3. 將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤中，膠條的正極（標(biāo)有+）對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極，確保膠條與電極緊密接觸。

    4. 在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油。

    5. 對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。

    6. 聚焦結(jié)束的膠條，立即進(jìn)行平衡、第二向SDS-PAGE電泳?；?qū)⒛z條置于樣品水化盤中，-20℃冰箱保存，電泳前取出膠條，室溫放置10分鐘，使其溶解。

    第二向SDS-PAGE電泳：

    1. 配制12%的丙烯酰胺凝膠。

    2. 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ水沖洗。

    3. 配制膠條平衡緩沖液I

    4. 在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品，這樣可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋。

    5. 將膠條轉(zhuǎn)移至樣品水化盤中，加入6ml(17cm IPG)平衡緩沖液I，在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。

    6. 配制膠條平衡緩沖液II。

    7. 第1次平衡結(jié)束后，取出膠條將之豎在濾紙上瀝去多余的液體，放入平衡緩沖液II中，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。

    8. 用濾紙吸去SDS-PAGE膠上方玻璃板間多余的液體，將二向凝膠放在桌面上，凝膠的頂部面對(duì)自己。

    9. 將瓊脂糖封膠液加熱溶解。

    10. 在100ml量筒中加入TGS電泳緩沖液。

    11. 第二次平衡結(jié)束后，取出膠條，用濾紙吸去多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。

    12. 用鑷子夾住膠條的一端使膠面*浸末在1×電泳緩沖液中漂洗數(shù)次。

    13. 將膠條背面朝向玻璃板，輕輕放在長(zhǎng)玻板上，加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。

    14. 用適當(dāng)厚度的膠片,輕輕地將膠條向下推,使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面*接觸.注意:不要在膠條下方產(chǎn)生氣泡，應(yīng)推動(dòng)凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。

    15. 放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液凝固。

    16. 打開二向電泳制冷儀，調(diào)溫度為15℃。

    17. 將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中，加入電泳緩沖液，接通電源，起始時(shí)用的低電流（5mA~10mA/gel/17cm），待樣品在*走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（20-30mA/gel/17cm）待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。

    18. 電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號(hào)（戴手套，防止污染膠面）。

    19. 進(jìn)行染色。

    雙向電泳蛋白點(diǎn)的切取和保存：

    1. 用PDQuest軟件或肉眼比對(duì)，找出感興趣的蛋白點(diǎn)，并做好標(biāo)記和記錄。

    2. 用MilliQ水沖洗膠2次。

    3. 用色譜純甲醇和MilliQ水沖洗Ep管

    4. 將槍頭(200?l)下端剪去，使其內(nèi)徑略小于蛋白斑點(diǎn)的直徑，用色譜純甲醇和MilliQ水沖洗槍頭。

    5. 對(duì)準(zhǔn)斑點(diǎn)中央小心將蛋白切割下來，放入Ep管，MilliQ水漂洗2次，如膠塊太大，將其切成1 x 1 mm的膠片。

    6. 將切好的點(diǎn)做好標(biāo)記和記錄，置-80oC保存或凍干后-20oC存放。

    注意事項(xiàng)：

    1. 盡量避免皮膚和頭發(fā)的角蛋白的污染，在操作過程中應(yīng)戴一次性的PE手套（不用乳膠手套）和帽子。

    2. 不要將膠長(zhǎng)期存放于乙酸溶液中。

    3. Ep管及染膠的容器必須用甲醇和水充分清洗，尤其應(yīng)與進(jìn)行Western blotting的容器分開，以避免casein或BSA的污染。