近年來，隨著檢測參數(shù)越來越多，流式細胞儀也日漸普及。不過，盡管多個參數(shù)同時分析可帶來大量信息，但在樣品制備過程中必須采取適當?shù)拇胧?，才能保證流式數(shù)據(jù)是相關(guān)的。如何才能少走彎路，下面聽聽各位專家的建議。

1. 從采集那一刻開始

流式分析所用的樣品是十分多樣化的，從細胞、血液到組織等。這些需要不同的樣品采集和處理方法。“血液或組織樣品通常在分析前幾天、幾周甚至幾個月采集，比如大型隊列研究，”美天旎的產(chǎn)品經(jīng)理Johannes Fleischer解釋說，“若保存不當，可能會影響結(jié)果。為了實現(xiàn)高度標準化，建議使用專門的組織保存試劑、冷凍干燥或保存在-80℃，以減少實驗可變性。”

2. 是否需要富集細胞？

BioLegend的技術(shù)服務(wù)專家Ekaterina Zvezdova表示：“通常，人們利用抗體或細胞因子等刺激物處理后，使用流式細胞儀來評估細胞的活化狀態(tài)。然而，對細胞的刺激往往會導(dǎo)致表面受體內(nèi)化。例如，抗CD3抗體對T細胞的刺激導(dǎo)致T細胞表面的TCR/CD3復(fù)合物下調(diào)，因此無法通過CD3或TCR分子來鑒定異質(zhì)群體中的T細胞。”

他認為，研究人員需要預(yù)測不同處理方式對特定細胞標志物的影響，從而制定有效的策略來收集數(shù)據(jù)。比如，在細胞鑒定時采用替代性的譜系標志物，或者在刺激之前就富集感興趣的細胞亞群。

Fleischer也強調(diào)了富集細胞的好處。他解釋說，稀有細胞，比如循環(huán)腫瘤細胞、造血干細胞和抗原特異性T細胞，在流式實驗中是很難捕獲的。“使用與抗體偶聯(lián)的磁珠，可以富集這些稀有細胞，”他說。美天旎的MACSQuant Analyzer流式細胞儀可與磁性富集柱相整合，從而實現(xiàn)自動化的細胞富集。

3. 解離細胞有何影響？

*，流式分析需要單細胞懸液，因此當研究人員分析實體組織的細胞時，首先需要解離樣品。機械解離和酶解消化都是常用的方法，但兩者都會引起細胞應(yīng)激，并導(dǎo)致細胞存活率不高。

“為了提高重復(fù)性，我們開發(fā)出GentleMACS?解離設(shè)備，這種自動化的儀器帶有預(yù)先設(shè)好的程序，可以更溫和地解離特定的生物材料，”Fleischer解釋說。“我們還設(shè)計出一系列組織特異性的解離緩沖液，作為GentleMACS設(shè)備的補充。我們已經(jīng)生成了大量的測試數(shù)據(jù)，證明它們可以更好地保留細胞表面的表位。”

Zvezdova也指出，酶解消化往往會影響抗體結(jié)合的表位。“例如，貼壁細胞經(jīng)過胰蛋白酶處理會導(dǎo)致鈣粘蛋白的切割和失活，使得對應(yīng)的抗體難以識別其靶點。為了減少這些影響，使用更溫和的解離溶液是明智之舉，如Accutase?。”

無論采用哪種形式的解離，F(xiàn)leischer都建議使用細胞濾網(wǎng)進行過濾，以去除樣品中的團塊。“大多數(shù)研究人員在流式分析中都遇到過進樣管堵塞的痛苦時刻，而細胞濾網(wǎng)是避免堵塞和外溢的關(guān)鍵工具，”他說。

4. 固定也需要優(yōu)化

固定這個步驟也會影響抗體結(jié)合表位。一些抗體用于固定細胞染色時表現(xiàn)出信號損失。“我們對一些抗體克隆進行了內(nèi)部測試，比較了未固定的細胞以及染色前用4%多聚甲醛固定的細胞，”Zvezdova說。“這些結(jié)果顯示了固定表位的染色是否有可能成功，如果您的抗體克隆未提供相關(guān)信息，我們通常建議在固定細胞前進行表面染色。”

溫度也會明顯影響抗體結(jié)合，導(dǎo)致趨化因子和細胞因子受體等表面蛋白的快速內(nèi)化。如果要在固定前對細胞進行染色，那么在室溫或37℃下進行抗體孵育，而不是4℃。

5. Fc封閉可降低背景

抗體與免疫細胞上的Fc受體結(jié)合是造成背景染色的主要原因，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果，或掩蓋低豐度靶點的存在。因此，在開展免疫染色之前，加入Fc封閉步驟。“盡管使用Fc封閉試劑可減少背景染色，但這會導(dǎo)致實驗操作中多了一步，并可能造成細胞損失，”Fleischer指出。

“為了讓Fc封閉不再成為必需，我們開發(fā)出了REAfinity?重組抗體。這些抗體的Fc區(qū)域經(jīng)過改造，不再與Fc受體結(jié)合，能夠產(chǎn)生一致性更好的流式分析數(shù)據(jù)，”他說。

6. 巧用活細胞染料

Nanna Therapeutics的科學(xué)家Catherine Klapholz認為：“在樣品制備過程的多個階段進行細胞計數(shù)，以確認未出現(xiàn)明顯的細胞損失，這是一種明智的做法?；罴毎玖峡商峁┯杏玫男畔ⅲ嬷煌闹苽浼夹g(shù)對整個細胞群的影響。不過，必須測試染色的穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)采集有時需要1-2小時，并且是在室溫甚至4℃下，則信號有可能會急劇增加。”

無論我們對樣品制備過程采用多么精心的優(yōu)化，但適用于A細胞的方案不一定適用于B細胞，正所謂“甲之蜜糖，乙之pi霜”。只有為每種細胞量身定制不同的樣品制備方案，我們的流式細胞分析才有可能獲得成功。