與所有的檢測(cè)方法一樣，western blot數(shù)據(jù)的質(zhì)量和定量是在檢測(cè)過(guò)程中薄弱、變化多的環(huán)節(jié)。準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性差的步驟將限制western blot定量程度。小編提供了實(shí)用的實(shí)驗(yàn)操作的建議，關(guān)于如何獲得高質(zhì)量的、定量的western blot數(shù)據(jù)，以便您可以得出穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.定量的定義

在討論如何從western blot中獲得定量數(shù)據(jù)之前，先定義一下我們所說(shuō)的“定量”是什么意思是很有用的，何為定量，必須符合下列準(zhǔn)則：

? 使用一個(gè)定義的過(guò)程進(jìn)行測(cè)量，即western blot
? 這個(gè)過(guò)程產(chǎn)生一個(gè)可重復(fù)的結(jié)果，即是度
? 測(cè)量反映了一個(gè)“真實(shí)”的結(jié)果，即是準(zhǔn)確度

Western blot過(guò)程需要明確定義以及盡可能保持一致的步驟，數(shù)據(jù)需要可重復(fù)，并且數(shù)據(jù)應(yīng)該與使用正交方法收集的數(shù)據(jù)一致，例如質(zhì)譜分析法。

在本文中，我們將重點(diǎn)討論如何滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，強(qiáng)調(diào)在哪些地方需要特別注意一致性或執(zhí)行試劑驗(yàn)證和質(zhì)控，可以獲得western blot可靠性和重現(xiàn)性的數(shù)據(jù)。

2.使用相同的方法處理樣品

一致的樣品制備和處理是產(chǎn)生定量western數(shù)據(jù)的重要的步。甚至是孵育時(shí)間、buffer成分或溫度上的微小差異(可變的室溫，在-20℃冷凍與在冰上保存)，也會(huì)顯著降低western blot數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。一旦建立了可靠的細(xì)胞或組織裂解和樣品處理方案，在準(zhǔn)備相互比較的樣品時(shí)，應(yīng)盡可能地遵循該程序。

3.抗體驗(yàn)證

期刊雜志需要一些抗體驗(yàn)證的信息，事實(shí)上，對(duì)于檢測(cè)感興趣蛋白，這是一個(gè)很好的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在你自己的實(shí)驗(yàn)室里用你自己的樣本和技術(shù)來(lái)驗(yàn)證抗體。這在使用以前從未發(fā)表過(guò)的抗體時(shí)尤其重要。

僅僅驗(yàn)證你的抗體檢測(cè)到蛋白在預(yù)期分子量是不夠的。重要的是要表明結(jié)合是特定于目標(biāo)蛋白的，通過(guò)多種方法?？贵w驗(yàn)證工作組已經(jīng)發(fā)布了一套很好的建議，其中列出了五種不同的抗體驗(yàn)證方法。其中四種適用于驗(yàn)證Western blotting中使用的抗體，我們?cè)谶@里總結(jié)了這些驗(yàn)證方法。

? 基因驗(yàn)證：通過(guò)敲除基因或通過(guò)RNAi消除目標(biāo)蛋白的翻譯，通過(guò)顯示蛋白表達(dá)信號(hào)被消除或減少來(lái)證明抗體的特異性。
? 正交驗(yàn)證：證明使用抗體測(cè)量蛋白豐度與使用質(zhì)譜法等正交方法測(cè)量蛋白豐度有很大相關(guān)性。
? 獨(dú)立抗體：證明使用你自己的抗體測(cè)量蛋白豐度與使用第二種已驗(yàn)證的抗體測(cè)量蛋白豐度密切相關(guān)，該抗體可以識(shí)別同一目標(biāo)蛋白上不同的、不重疊的表位。
? 標(biāo)記蛋白表達(dá)(這是獨(dú)立抗體方法的一種特殊變體)：表達(dá)一個(gè)帶有附加表位標(biāo)簽的靶蛋白，并指出使用你自己抗體測(cè)量蛋白豐度與使用識(shí)別表位標(biāo)記的驗(yàn)證抗體測(cè)量蛋白豐度相關(guān)性。

請(qǐng)注意，抗體驗(yàn)證是特定于應(yīng)用程序的——為ELISAs驗(yàn)證的抗體不為western blotting驗(yàn)證(反之亦然)，因?yàn)榻Y(jié)合發(fā)生在明顯不同的條件下。

4.驗(yàn)證信號(hào)線性，優(yōu)化動(dòng)態(tài)范圍

為了從western blot中獲得準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果，您需要確保檢測(cè)到的信號(hào)與當(dāng)前的蛋白量成正比，換句話說(shuō)，檢測(cè)在線性范圍內(nèi)。然而，在western blotting過(guò)程中有多個(gè)步驟可以導(dǎo)致信號(hào)飽和，因此需要在每個(gè)步驟中驗(yàn)證信號(hào)的線性。注意，其中許多步驟還可以優(yōu)化，以大限度地提高信號(hào)的動(dòng)態(tài)范圍。

驗(yàn)證所使用的樣本量在線性范圍內(nèi)

為了獲得穩(wěn)健的定量蛋白印跡數(shù)據(jù)，我們建議生成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，涵蓋您將評(píng)估的全部樣品量，測(cè)試每個(gè)量的多個(gè)重復(fù)樣品（圖1）。信號(hào)強(qiáng)度與樣本量的關(guān)系圖將表明您可以加載多少蛋白，并且仍然可以確信您的信號(hào)處于線性范圍內(nèi)。

請(qǐng)注意，應(yīng)確定每個(gè)抗體 - 蛋白對(duì)應(yīng)的系統(tǒng)線性范圍。

檢查轉(zhuǎn)印條件對(duì)信號(hào)線性的影響

膜能容納蛋白的數(shù)量可能飽和。我們建議測(cè)試幾個(gè)轉(zhuǎn)印時(shí)間，并選擇可形成線性信號(hào)的短時(shí)間。如果在測(cè)試的所有轉(zhuǎn)印時(shí)間信號(hào)都保持飽和狀態(tài)，那么很可能是其他的步驟導(dǎo)致了信號(hào)飽和。在這種情況下，可以繼續(xù)優(yōu)化其他參數(shù)，然后返回轉(zhuǎn)印時(shí)間，驗(yàn)證膜容量是否飽和。

滴定抗體

我們建議針對(duì)您期望檢測(cè)的全部靶蛋白量測(cè)試不同的抗體稀釋度。 這將確保您的檢測(cè)靈敏度足以檢測(cè)低量的目標(biāo)蛋白，并且具有足夠?qū)挼膭?dòng)態(tài)范圍，可檢測(cè)到zui高量的蛋白仍處于線性范圍內(nèi)（圖2）。

圖2.滴定一抗，尋找*稀釋倍數(shù)。在10 mL Azure化學(xué)發(fā)光封閉緩沖液中
加入三種不同量的一抗，其他western blot條件不變。*抗體加入量是5 μL。

優(yōu)化圖像采集時(shí)間

評(píng)估線性的后一步是印跡到檢測(cè)系統(tǒng)的曝光時(shí)間，無(wú)論是膠片還是數(shù)字成像儀或掃描儀。 都需要有個(gè)合理的曝光時(shí)間保證能檢測(cè)到弱信號(hào)蛋白同時(shí)強(qiáng)信號(hào)蛋白還不過(guò)曝，仍處于線性范圍內(nèi)。

選擇合適的底物液用于定量化學(xué)發(fā)光western blot

通過(guò)適當(dāng)?shù)馁|(zhì)控和正確的ECL底物化學(xué)發(fā)光也可以定量。選擇一個(gè)動(dòng)態(tài)范圍廣，靈敏度高，半衰期長(zhǎng)的底物液進(jìn)行可靠和可重復(fù)的定量。

動(dòng)態(tài)范圍受檢測(cè)技術(shù)的影響

膠片的動(dòng)態(tài)范圍通常在1 log范圍內(nèi)，這是一個(gè)相當(dāng)窄的動(dòng)態(tài)范圍。相比之下，PMT（光電倍增管）的動(dòng)態(tài)范圍可以在大約6.3log。

5.總蛋白歸一化

歸一化對(duì)于可靠的western blot定量是至關(guān)重要的——通過(guò)找到一個(gè)期望在不同樣品和條件下保持不變的量，您可以質(zhì)控樣品制備、上樣和轉(zhuǎn)印的變化，并生成目標(biāo)蛋白對(duì)該不變特征的相對(duì)值。

一種廣泛使用的方法是使用看家蛋白進(jìn)行歸一化，例如GAPDH， tubulin和 actin，其被認(rèn)為具有穩(wěn)定且不變的表達(dá)水平。 近的一系列研究表明這種假設(shè)有很多缺陷，現(xiàn)在許多免疫印跡專家和科學(xué)期刊，如Journal of Biological Chemistry雜志，建議使用總蛋白進(jìn)行歸一化。而不是看家蛋白質(zhì)，除非用于歸一化的看家蛋白進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)驗(yàn)證2,4,5,6

6.使用一致的western blot協(xié)議

仔細(xì)嚴(yán)格地遵循既定方案有助于減少變異性并提高測(cè)量度，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健的定量蛋白印跡。 您不僅應(yīng)該通過(guò)使用相同的試劑或?qū)嵤┡螌?duì)照來(lái)減少變異性，保持孵育和洗滌時(shí)間相同也有助于確保一致和可靠的結(jié)果。