據(jù)估計(jì)，因抗體質(zhì)量不佳， 生命科學(xué)領(lǐng)域每年的損失達(dá)到 8 億美元。這也造成了無(wú)數(shù)的實(shí)驗(yàn)失敗，浪費(fèi)了寶貴的資源和科學(xué)家的時(shí)間。盡管科學(xué)界已經(jīng)意識(shí)到這個(gè)問(wèn)題，但目前仍然缺乏抗體驗(yàn)證的整體框架。

為了刺激研究界實(shí)現(xiàn)更高標(biāo)準(zhǔn)的抗體重復(fù)性，抗體驗(yàn)證工作組（IWGAV）于 2016 年 9 月份出臺(tái)了一套抗體驗(yàn)證指南并發(fā)表在《Nature Methods》雜志上， 題為「A Proposal for Validation of Antibodies」, 強(qiáng)調(diào)了抗體驗(yàn)證需要針對(duì)應(yīng)用和背景來(lái)開(kāi)展。文章提出了五點(diǎn)，以指導(dǎo)特定應(yīng)用中的抗體驗(yàn)證。

• 遺傳策略：測(cè)定對(duì)照細(xì)胞或組織中的相關(guān)信號(hào)，這些對(duì)照中的目標(biāo)基因已利用 CRISPR 或 RNAi 等技術(shù)敲除或敲低。

• 正交策略：利用不依賴(lài)抗體的方法定量多個(gè)樣品，然后檢查依賴(lài)抗體和不依賴(lài)抗體這兩種定量之間的相關(guān)性。

• 獨(dú)立抗體策略：找到多個(gè)抗體來(lái)識(shí)別目標(biāo)蛋白上面的不同表位，一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)的 C 端具有較好的親水性、表面可及性和柔性，所以是很好的抗原決定簇區(qū)域。在人蛋白質(zhì)中，約 81% 的蛋白質(zhì)其 C 末端的 5 個(gè)氨基酸殘基的小肽是該蛋白質(zhì)所*的，制備針對(duì)蛋白質(zhì) C 末端小肽的抗體，常常能得到特異性識(shí)別該全蛋白的抗體。另外，蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)是 B 細(xì)胞表位計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的重要參數(shù)之一，β轉(zhuǎn)角為凸出結(jié)構(gòu)，多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面，有利于與抗體結(jié)合，較可能成為抗原表位。而α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)規(guī)則不易變形，較難結(jié)合抗體，一般不作為抗原表位。含有 5 個(gè)以上的氨基酸殘基的轉(zhuǎn)角又常稱(chēng)為環(huán) (loop)。以往的研究表明，蛋白表面的 loop 區(qū)可能為功能性抗體的識(shí)別位點(diǎn)，特異性好，可及性強(qiáng)。利用這類(lèi)似抗原性分析結(jié)果，找到兩個(gè)或者多個(gè)獨(dú)立抗體，再通過(guò)比較和分析定量來(lái)確認(rèn)特異性。

• 表達(dá)標(biāo)記蛋白：修飾內(nèi)源的目標(biāo)基因，增加親和標(biāo)簽或熒光蛋白的序列。標(biāo)記蛋白的信號(hào)可與基于抗體的檢測(cè)相關(guān)聯(lián)。該方法有其局限性，當(dāng)目標(biāo)蛋白較小，或者結(jié)構(gòu)較敏感的時(shí)候，融合親和標(biāo)簽或者熒光蛋白有可能在結(jié)構(gòu)上影響目標(biāo)蛋白，從而改變其免疫原性。

• 免疫捕獲加上質(zhì)譜分析：將免疫捕獲與 MS 分析相結(jié)合，以確定與純化的抗體直接作用的蛋白質(zhì)，以及可能與目標(biāo)蛋白形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)。該方案能夠確定與純化的抗體直接作用的蛋白質(zhì)，以及可能與目標(biāo)蛋白形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)，但是需要依賴(lài)昂貴的儀器和實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)于一般實(shí)驗(yàn)室而言，難以普及。

通過(guò)比較上述五種方案，遺傳方案利用 CRISPR 或者 RNAi 技術(shù)敲除或者降低目的蛋白表達(dá)，是比較直接有效的方法，將敲除后細(xì)胞系作為負(fù)對(duì)照與野生型平行比較，如果抗體是真的特異的，在敲除細(xì)胞系中就不會(huì)檢測(cè)到目的蛋白的信號(hào)，但在野生型中就會(huì)檢測(cè)到特定的信號(hào)。因此，敲除驗(yàn)證的方法可以提供一個(gè)陰性對(duì)照用于驗(yàn)證抗體對(duì)目的蛋白的特異性。

該方法雖然直接，但是如果很難得到該基因敲除后細(xì)胞系，該實(shí)驗(yàn)方法的可行性將大幅度降低。不過(guò)隨著生命科學(xué)領(lǐng)域市場(chǎng)的不斷完善，商業(yè)化的 Knockout Cell（KO 細(xì)胞）裂解液已經(jīng)比較成熟。市面上銷(xiāo)售的多種細(xì)胞系 Knockout Cell（KO 細(xì)胞）裂解液已經(jīng)有上千種。如果您研究的目的基因正好有商業(yè)化 Knockout Cell（KO 細(xì)胞）裂解液，將節(jié)省您和大量的資源和寶貴的時(shí)間。

以圖為例 —— HER2 鼠單抗特異性的敲除驗(yàn)證：

WT: Hela 野生型細(xì)胞裂解液 (OriGene Cat# LC810 HELA),

KO: HER2-Knockout Hela 細(xì)胞裂解液 (OriGene Cat# LC810070),

Western blot 一抗：HER2 鼠單抗 (OriGene Cat# UM500036),

內(nèi)參抗體：ß-actin 鼠單抗 (OriGene Cat# TA811000),

使用濃度：1:500。

結(jié)論：該 HER2 鼠單抗 (OriGene Cat# UM500036) 經(jīng)敲除驗(yàn)證，具有*的特異性。