外泌體是由細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合后，釋放到細(xì)胞外的一種直徑約 30 ～ 150 nm 的膜性囊泡。幾乎所有的細(xì)胞都會產(chǎn)生外泌體，被分泌出的外泌體會進(jìn)入各種體液，通過循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)其他細(xì)胞與組織，產(chǎn)生遠(yuǎn)程調(diào)控作用。

越來越多的研究表明神經(jīng)系統(tǒng)中的生理功能和病理功能與外泌體密切相關(guān)，例如：參與神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元活動，參與神經(jīng)退行性疾病調(diào)控等。
 

本文中整理了一種可以從腦漿組織中分離和提取外泌體的操作步驟，供大家參考！

相關(guān)試劑：

1，Hibernate E Solution（BrainBits, Springfield）

2，木瓜蛋白酶 papain（Worthington）

3，Umibio Exosome Isolation Kit

4，PBS

相關(guān)設(shè)備：

1，勻漿器

2，網(wǎng)狀過濾器 40-μm

3，注射器過濾器 0.2μm

4，高速離心機(jī)

5，渦旋振蕩器

操作步驟：

一、腦漿液化處理：

1，將新鮮或先前冷凍的小鼠半腦切開，加入 Hibernate E 溶液 (3 mL /半腦)；

2，加入 20 單位/ mL 的木瓜蛋白酶，在 37℃ 水浴 15 分鐘；

3，加入等體積預(yù)冷 Hibernate E 后，輕輕勻漿；勻漿過程中在冰上進(jìn)行；

4，腦勻漿通過 40-μm 網(wǎng)狀過濾器過濾；

5，濾液再通過 0.2-μm 過濾器過濾，收集濾液；

二、液化腦漿預(yù)處理；

1，離心去碎片：將液化腦漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，于 4℃ 以 3000 g 離心 10 min，去除濾液中的碎片；離心后上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中；

2，離心去雜質(zhì)：轉(zhuǎn)移后的上清液于 4℃ 以 10000 g 離心 20 min，去除樣品中雜質(zhì)，將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；

三、腦漿外泌體的提取；
 

通過 Umibio Exosome Isolation Kit 提取外泌體顆粒。

1，上清液預(yù)處理：在去除雜質(zhì)的離心上清液中加入 Exosomoe Concentration Solution（ECS 試劑），具體的加入劑量如下：

注：其他劑量規(guī)格請根據(jù)表中的試劑用量等比例換算

2，溶液混合：加入 ECS 試劑后將離心管蓋緊，通過渦旋振蕩器混勻 1 min，再放置于 2℃ 至 8℃ 靜置 2 h；

3，沉淀外泌體：取出裝有混合液的離心管于 4℃ 以 10000 g 離心 60 min，棄上清，沉淀中富含外泌體顆粒；（注：盡可能吸凈上清液）

4，外泌體重懸：取 100μL 1×PBS 均勻吹打離心沉淀物，待其均勻懸浮在 PBS 中后，將重懸液轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 離心管中；

5，收獲外泌體顆粒：將含有重懸液的 1.5 mL 離心管于 4℃ 以 12000 g 離心 2 min，保留上清液，該上清液中富含外泌體顆粒。（注：若離心沉淀物肉眼可見，再離心一次）

6， 純化外泌體：將收獲的外泌體顆粒粗品轉(zhuǎn)入 Exosomoe Purafication Filter（EPF 柱）上室中，于 4℃ 以 3000 g 離心 10 min，離心后收集 EPF 柱管底的液體，此液體即為純化后的外泌體顆粒；

7，外泌體的保存：純化后的外泌體以保存于-80℃ 低溫冰箱中，以備后繼實驗使用。