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基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)(DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法)操作步驟

時(shí)間:2018-10-29閱讀:1623
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DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ,其原理還不清楚,可能是通過(guò)內(nèi)吞噬作用而使 DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核,此法只適合暫時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)染效率與DEAE-葡聚糖濃度以及 細(xì)胞 與 DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時(shí)間的長(zhǎng)短很有關(guān)系,可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時(shí)間(30分鐘-1.5小時(shí)),又可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長(zhǎng)時(shí)間(8小時(shí)).


方法如下:
(1)接種鼠L 成纖維細(xì)胞 濃度為5×105CO2/孔/皿生長(zhǎng)2~3天,當(dāng)達(dá)50%板底面積可用.


(2)乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo質(zhì)粒DNA,空氣干燥后溶于40μL的TE中,或取供體 DNA .


(3)用10ml 1×PBS、4mL、10%富合生長(zhǎng)因子血清的DMEM洗板(皿).


(4)在80μl熱的10g/L DEAE-葡聚糖中緩慢加入DNA,取120μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)細(xì)胞中,使其分布均勻輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)直到顯示均勻一致的紅色,培養(yǎng)4小時(shí).


(5)從孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖,加入5mL 10%DMSD,室溫放置1分鐘,吸出DMSO,用5mL 1×PBS洗一次吸出,加入10mL培養(yǎng)液(10%血清的DMEM).


(6)培養(yǎng)細(xì)胞,在適當(dāng)時(shí)間分析細(xì)胞,若含有抗藥基因,可用G418選擇培養(yǎng)液培養(yǎng),方法同前.
    *,科研工作者在進(jìn)行醫(yī)藥方面的科學(xué)研究之前,需要制定完善的統(tǒng)計(jì)研究設(shè)計(jì)方案,那么什么樣的設(shè)計(jì)方案才稱得上是完善的呢?一般來(lái)說(shuō),完善的設(shè)計(jì)方案需具備以下幾個(gè)條件:實(shí)驗(yàn)所需的人力、物力和時(shí)間資源;實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的“三要素”和“六原則”均符合專業(yè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)要求,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的收集、整理、分析等有一套規(guī)范的規(guī)定和正確的方法.而其中準(zhǔn)確把握統(tǒng)計(jì)研究設(shè)計(jì)的“三要素和六原則”,是科學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的核心.

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