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甲醛洋菜膠體電泳 (formaldehyde-agarose gel electrophoresis)甲醛是一種常用的RNA 變性劑。在進行甲醛洋菜膠體電泳分析時,必須先配制含有甲醛的洋菜膠體,RNA 也必須先以甲醛及formamide 進行變性處理,以確保其二度結(jié)構(gòu)充分被打開。由于甲醛可能是一種致癌物質(zhì),配制膠體及進行電泳分析時都應(yīng)在抽氣櫥里小心操作;進行電泳時所使用的緩沖液為MOPS (3-[N-morpholino] propanesulfonic acid)。此外,含有甲醛的洋菜膠體比較滑溜,容易破裂,在移動膠體時應(yīng)特別留神。
由于rRNA 占細胞RNA總量的80~85%,以ethidium bromide 染色后,呈現(xiàn)于膠體上的兩個主要RNA色帶應(yīng)該分別是large 與small rRNAs (真核生物為28S 與18S,原核生物為23S 與16S);散布于small rRNA 附近,呈淡淡smear 的就是mRNAs,這是因為mRNAs 存在量不多,而且長度不一的緣故。長度較短的5S rRNA 及tRNA 等則在膠體下方也以特定色帶呈現(xiàn)。
儀器用具:65℃恒溫水槽;微量離心機;Mupid II 迷你電泳槽及鑄膠器;UV transilluminator;防護面罩;拍立得相機;抽氣櫥
藥品試劑:
自菌體抽取的RNA (I-1, I-2, U-1, and U-2) 與胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所制備的正意股及反意股RNA
5×formaldehyde gel running buffer (0.1 M MOPS, pH 7.0; 40 mM sodium acetate; 5 mM EDTA)
Formaldehyde gel loading buffer (0.25% bromophenol blue; 0.25% xylene cyanol;50% glycerol; 1 mM EDTA)
Ethidium bromide (1 μg/μL in dH2O/DEPC)
dH2O/DEPC
方法步驟:
◆ 注意:
a. 下列實驗主要參照Sambrook and Russell (2001) 的方法。
b. 進行下列實驗時請務(wù)必戴手套。
c. 甲醛與formamide 都放在抽氣櫥內(nèi)。
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