簡(jiǎn)介：這種DNA損傷分析試劑盒用于測(cè)定損傷的8.2kb大鼠體內(nèi)和體外的線粒體DNA，在QPCR分析后用實(shí)時(shí)PCR定量復(fù)制的DNA。該試劑盒可對(duì)多達(dá)20個(gè)樣本進(jìn)行重復(fù)分析（40個(gè)反應(yīng)）。

艾美捷大鼠實(shí)時(shí)定量PCR DNA損傷分析試劑盒#DD2R組分：

? 2X濃縮QPCR緩沖液（450µL）

? QPCR引物混合物【正向引物和反向引物各2μM】（225μL）

? QPCR檢測(cè)DNA[50納克/μL]（10μL）

? 5X增強(qiáng)劑（180μL）

? 8.2 kb實(shí)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)[1ng/uL]（25μL）

? 實(shí)時(shí)引物混合物【正向引物和反向引物各5μM】（100μL）

不包括在套件中：

? SYBR Green Mix（可單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)）

? 不含核酸酶的水

? PCR管和蓋

DNA損傷分析試劑盒相關(guān)程序分析：

1.QPCR熱循環(huán)儀程序

? 此配置文件的預(yù)編程PCR機(jī)器：

a.98°C，30秒

b.98°C，10秒

c.63°c，10秒

d.72°C，4分鐘

e.30個(gè)循環(huán)（步驟b至d）。

f.72°C，10分鐘

g.4°C

程序：以下程序適用于每20μL的反應(yīng)。增加所有金額

根據(jù)管道總數(shù)成比例。

? 每個(gè)PCR管（20μL Rx），混合以下物質(zhì)：

a.10.0μL 2X QPCR濃縮緩沖液

b.4.0μL 5倍增強(qiáng)劑

c.5.0μL QPCR引物混合物（每個(gè)引物2μM，正向/反向）

d.1.0μL DNA（50納克/μL）

*等分反應(yīng)前的渦流儲(chǔ)備緩沖液

2.實(shí)時(shí)PCR程序（用于20μL實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)）

? 建議將來(lái)自QPCR的PCR DNA產(chǎn)物稀釋10倍

在進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR步驟之前用不含核酸酶的水。

? 混合以下物質(zhì)：

o 10μL SYBR綠色混合物（不包括在試劑盒中）

o 7.1μL H2O（無(wú)核酸酶）

o 0.9μL實(shí)時(shí)引物混合物（每個(gè)引物5μM）

o 2.0μL DNA樣本（來(lái)自上述QPCR的PCR產(chǎn)物）

? 對(duì)于8.2kb的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以下優(yōu)化的DNA濃度為

推薦：

o 2納克/2μL H2O**

o 200 pg/2μL H2O

o 20 pg/2μL H2O

o 2 pg/2μL H2O

o 0.2 pg/2μL H2O

o 0.02 pg/2μL H2O

o 0頁(yè)/2m1小時(shí)20分

**8.2kb實(shí)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)

推薦的實(shí)時(shí)PCR程序

a） 50攝氏度2分鐘

b） 95攝氏度10分鐘

（程序40個(gè)c和d循環(huán)）

c） 95攝氏度15秒

d） 60攝氏度60秒

計(jì)算：

使用閾值循環(huán)值（CT）和DNA創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線

8.2kb標(biāo)準(zhǔn)品中每一個(gè)的濃度（對(duì)數(shù)標(biāo)度）。使用線性回歸

分析，根據(jù)您的CT值確定樣本的DNA濃度

通過(guò)PCR獲得。高水平的8.2kb產(chǎn)物代表較少的mtDNA損傷。

Detroit R&D整套DNA損傷分析試劑盒可用于人、大鼠或小鼠的血液、細(xì)胞或組織。由于缺失和鏈斷裂造成的DNA損傷可以用此試劑盒檢測(cè)，使用微板格式的DNA分離技術(shù)，該試劑盒可以很容易地用于高通量格式。在這方面，Detroit R&D研發(fā)分析是一個(gè)很有前途的工具，因?yàn)榭焖伲僮骱?jiǎn)單，只需要少量的測(cè)試物質(zhì)。