膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組分之一，膠原水平的過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致疾病。例如：膠原過(guò)多會(huì)導(dǎo)致組織纖維化，過(guò)少會(huì)導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎。因此在許多疾病研究中檢測(cè)膠原水平非常重要。
 

　　艾美捷 Biovision總膠原蛋白檢測(cè)試劑盒(比色法)基于樣品中膠原蛋白酸水解產(chǎn)生水解產(chǎn)物和羥脯氨酸，羥脯氨酸被進(jìn)一步氧化代謝產(chǎn)生有色產(chǎn)物，于560 nm處有吸收峰.
 

　　該膠原蛋白檢測(cè)試劑盒組分：
 

　　1、96孔平底透明板
 

　　2、多阱分光光度計(jì)
 

　　3、12 M鹽酸(濃鹽酸)
 

　　4、水解：聚丙烯小瓶(BV類別號(hào)M1352)和螺帽
 

　　艾美捷 Biovision膠原蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方案：
 

　　1.樣品制備：組織或蛋白質(zhì)/肽樣品：組織樣品(即肺)應(yīng)在ddH2O中均勻化，使用100µl每10 mg組織使用ddH2O。向100µl樣品勻漿中添加100µl濃HCl(~12 M，未提供)，并將其放入一個(gè)壓力合適的聚丙烯螺旋小瓶中。在120°C下水解樣品3小時(shí)(見(jiàn)注釋C)。尿液：用等量水水解樣品壓力密封聚丙烯螺旋蓋小瓶中12m濃HCl(即100µl尿液+100µl HCl)的體積。之后均質(zhì)，通過(guò)添加4 mg活性炭，用活性炭澄清樣品。以10000 x g的速度旋轉(zhuǎn)并離心3小時(shí)至少清除沉淀和活性炭。如果需要，重復(fù)上述步驟。將2-30µl各水解樣品轉(zhuǎn)移至96孔板中，并通過(guò)在熱板/干熱塊或微孔板培養(yǎng)箱上70°C加熱板蒸發(fā)至干燥。
 

　　注意：
 

　　A.對(duì)于未知樣品，建議進(jìn)行初步試驗(yàn)，以確保讀數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，并且相應(yīng)地調(diào)整樣品水解液的體積(可使用2-30µl水解液)或在必要時(shí)稀釋水解液。
 

　　B對(duì)于膠原蛋白濃度J低的樣品，建議平行運(yùn)行兩個(gè)測(cè)試樣品井，并加一個(gè)使用已知量的I型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(4.0µg)，以確保準(zhǔn)確測(cè)定。
 

　　C對(duì)于樣品水解，帶有緊配合螺旋蓋(無(wú)O形圈)的聚丙烯小瓶產(chǎn)生zui佳結(jié)果。推薦Biovision的聚丙烯瓶和蓋(類別號(hào)M1353和M1352)。
 

　　圖：(a)水解膠原蛋白I標(biāo)準(zhǔn)曲線(0-10µg)。(b) 大鼠組織中總膠原濃度的估算。鼠腎，肝、肺和肌肉樣品用ddH2O均質(zhì)，并在120°C下用12 M HCl水解3小時(shí)。沉淀被分離通過(guò)離心(10000 x g，持續(xù)3分鐘)去除。根據(jù)試劑盒測(cè)定30微升水解樣品協(xié)議。膠原含量(mg膠原/g濕組織)：腎臟：2.01±0.22；肝臟：0.71±0.32；肺：3.03±0.3；肌肉：3.25±0.98。