基礎(chǔ)知識(shí)背景 — 什么是小G蛋白？
小G蛋白(Small G Protein)因分子量只有20—30KD而得名，同時(shí)具有GTP酶活性，小G蛋白家族成員在細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)揮分子開(kāi)關(guān)的功能，參與調(diào)控很多生物學(xué)過(guò)程。小G蛋白的共同特點(diǎn)是，當(dāng)結(jié)合了GTP時(shí)即成為活化形式，這時(shí)可作用于下游分子使之活化，而當(dāng)GTP水解成為GDP時(shí)（自身為GTP酶）則恢復(fù)到非活化狀態(tài)。這一點(diǎn)與G蛋白里的Gα類(lèi)似，但是小G蛋白的分子量明顯低于Gα。
在細(xì)胞中存在著一些專門(mén)控制小G蛋白活性的小G蛋白調(diào)節(jié)因子，有的可以增強(qiáng)小G蛋白的活性，如鳥(niǎo)苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor, GEF）和鳥(niǎo)苷酸解離抑制因子（Guanine nucleotide dissociation Inhibitor, GDI），有的可以降低小G蛋白活性，如GTP酶活化蛋白（GTPase activating protein, GAP）。
個(gè)被發(fā)現(xiàn)的小G蛋白是Ras，它是Ras基因的產(chǎn)物。小G蛋白的Ras超家族由超過(guò)150個(gè)成員組成，基于它們的序列同源性，被分成若干亞家族，例如Rho，Ras，Ran，Rab，Arf和Rad / Rem / Gem / Kir。
小G蛋白超家族成員及其相關(guān)功能：
Ras | 細(xì)胞增殖 | DIRAS1; DIRAS2; DIRAS3; ERAS; GEM; HRAS; KRAS; MRAS; NKIRAS1; NKIRAS2; NRAS; RALA; RALB; RAP1A; RAP1B; RAP2A; RAP2B; RAP2C; RASD1; RASD2; RASL10A; RASL10B; RASL11A; RASL11B; RASL12; REM1; REM2; RERG; RERGL; RRAD; RRAS; RRAS2 |
Rho | 細(xì)胞骨架的動(dòng)力與形態(tài) | RHOA; RHOB; RHOBTB1; RHOBTB2; RHOBTB3; RHOC; RHOD; RHOF; RHOG; RHOH; RHOJ; RHOQ; RHOU; RHOV; RND1; RND2; RND3; RAC1; RAC2; RAC3; CDC42 |
Rab | 膜轉(zhuǎn)運(yùn) | RAB1A; RAB1B; RAB2; RAB3A; RAB3B; RAB3C; RAB3D; RAB4A; RAB4B; RAB; RAB5B; RAB5C; RAB6A; RAB6B; RAB6C; RAB7A; RAB7B; RAB7L1; RAB8A; RAB8B; RAB9; RAB9B; RABL2A; RABL2B; RABL4; RAB10; RAB11A; RAB11B; RAB12; RAB13; RAB14; RAB15;RAB17; RAB18; RAB19; RAB20; RAB21; RAB22A; RAB23; RAB24; RAB25; RAB26; RAB27A; RAB27B; RAB28; RAB2B; RAB30; RAB31; RAB32; RAB33A; RAB33B; RAB34; RAB35; RAB36; RAB37; RAB38; RAB39; RAB39B; RAB40A; RAB40AL;RAB40B; RAB40C; RAB41;RAB42; RAB43 |
Rap | 細(xì)胞粘附 | RAP1A; RAP1B; RAP2A; RAP2B; RAP2C |
Arf | 囊泡轉(zhuǎn)運(yùn) | ARF1; ARF3; ARF4; ARF5; ARF6; ARL1; ARL2; ARL3; ARL4; ARL5; ARL5C; ARL6; ARL7; ARL8; ARL9; ARL10A; ARL10B; ARL10C; ARL11; ARL13A; ARL13B; ARL14; ARL15; ARL16; ARL17; TRIM23, ARL4D; ARFRP1; ARL13B |
Ran | 核運(yùn)輸 | RAN |
Rheb | mTOR途徑 | RHEB; RHEBL1 |
RGK | | RRAD; GEM; REM; REM2 |
Rit | | RIT1; RIT2 |
Miro | 線粒體轉(zhuǎn)運(yùn) | RHOT1; RHOT2 |
Ras蛋白主要參與細(xì)胞增殖和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；Rho蛋白對(duì)細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；Rab蛋白則參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)膜交通（membrane traffic），其他家族成員也在細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)揮著非常重要的作用。
因此，研究GTP酶（GTPase）的活化調(diào)控機(jī)制具有廣泛而深遠(yuǎn)的生物學(xué)意義。
傳統(tǒng)檢測(cè)Rho 蛋白活化水平的方法主要為pull-down檢測(cè)。pull-down法往往存在耗時(shí)長(zhǎng)、需要樣本量大、不太適合高通量檢測(cè)等缺點(diǎn)。為克服傳統(tǒng)方法這些方面的缺點(diǎn)，Cytoskeleton公司開(kāi)發(fā)了新一代的G-LISA™檢測(cè)方法，用于快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)GTP酶活化水平。
G-LISA實(shí)驗(yàn)原理及操作步驟
1.首先將效應(yīng)蛋白的受體結(jié)合域（RBD）包被96孔板；
2.樣本中GTP(活化狀態(tài))結(jié)合形式的蛋白分子則可結(jié)合到板上，而GDP(無(wú)活性狀態(tài))結(jié)合形式蛋白則不結(jié)合；
3.洗去未結(jié)合的蛋白；
4.然后依次加入特異性的一抗和HRP-二抗進(jìn)行孵育結(jié)合；
5.后利用合適的酶底物OPD或化學(xué)發(fā)光試劑顯色。
Swiss 3T3 細(xì)胞中，Activators活化的Rho蛋白（左）和Rac蛋白（右）
傳統(tǒng)Pull down法和G-LISA法的比較
原理 | 用包被效應(yīng)蛋白的親和磁珠選擇性的結(jié)合有活性的GTPase，用western blot檢測(cè)信號(hào) | 用包被效應(yīng)蛋白的96孔板選擇性的結(jié)合有活性的GTPase 用ELISA檢測(cè)信號(hào) |
實(shí)驗(yàn)設(shè)備 | SDS-PAGE、Western blot相關(guān)儀器 | ELISA相關(guān)儀器 |
上樣量 | 300 - 2000 µg per assay | 5 - 50 µg per assay |
樣品數(shù)量 | Up to 10 samples | Up to 96 samples (or more) |
結(jié)果定量 | WB具有很窄的線性范圍。此外，樣品的多次操作也會(huì)導(dǎo)致某種程度上的變異分析。 | 提供定量的數(shù)字讀數(shù) |
反應(yīng)時(shí)間 | 10-12h | ＜3h |
G-LISA法對(duì)比傳統(tǒng)的pull down，主要有操作簡(jiǎn)便、上樣量少、可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本、反應(yīng)時(shí)間短、定量結(jié)果準(zhǔn)確、與小鼠、大鼠和人的組織和細(xì)胞兼容等優(yōu)勢(shì)。
小G蛋白活化檢測(cè)試劑盒Pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示：
Lanes 4 & 5:10 ng/ ml of EGF， 2min
Lanes 2 & 3: Persistent serum starvation
Lanes 1: 20 ng of recombinant Rac1-His protein run as a western blot standard
小G蛋白活化檢測(cè)試劑盒G-LISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示：
分別用CN01（藍(lán)色Activators）和LPA（紅色）處理后RhoA的活化進(jìn)程
會(huì)員1.png)