1.赤羽病病毒(AKV)的滴定或純化
(1) 于55mm直徑的滅菌塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)綠猴腎細(xì)胞(Vero)，使形成單層。細(xì)胞培養(yǎng)時間約3－4天，接種量約為2 000 000/ml個細(xì)胞。選取單層細(xì)胞全部覆蓋，不留有空洞的培養(yǎng)皿用作試驗。
(2) 用細(xì)胞培養(yǎng)液對AKV病毒作10倍倍比稀釋至10-7并保存于4℃。ELISA試劑盒
(3) 每個稀釋度的病毒液接種3個平皿。
(4) 接種前棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,用5mlPBS或細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗單層細(xì)胞,然后棄去沖洗液。
(5) 每個平皿分別加入0.2ml病毒稀釋液，對照組只用細(xì)胞培養(yǎng)液代替，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱吸附一小時，每15分鐘搖動一次，以便使病毒均勻分布。
(6) 按第4步驟沖洗未被吸附的病毒。
(7) 取2倍濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)液加入等量的1.5％瓊脂(預(yù)熱)中，每個平皿加入7ml，置平臺待冷卻凝固后于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)約2天，平皿需倒置。
(8) 取2倍濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)液加入等量的2％瓊脂(預(yù)熱)中，每個平皿加入5ml，置平臺待冷卻凝固后于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至次日。ELISA試劑盒
(9) 結(jié)果計算 求每組三個培養(yǎng)皿的蝕斑平均數(shù)，組間蝕斑數(shù)的差異應(yīng)符合稀釋度的規(guī)律 (即若10-2組平均100個蝕斑，則10-3組平均應(yīng)在10個左右)，否則應(yīng)考慮重新試驗。以平均蝕斑數(shù)乘以病毒稀釋的倍數(shù)再乘以5，即為每毫升病毒原液的蝕斑數(shù)。
(10) 選取特征性的若干蝕斑，分別以彎頭吸管在瓊脂層下吸取蝕斑以收獲病毒，然后分別接種到預(yù)先制備的單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行增殖或傳代。
(11) 本試驗采用BHK21細(xì)胞，可應(yīng)用于牛流行熱病毒(BEFV)。
2.藍(lán)舌病病毒(BTV)血清型鑒定試驗(紙片法)
(1) 抗體紙片制備
① 取已知各種血清型毒株以1×107蝕斑形成單位接種綿羊, 接種后3-4周采血分離血清。
② 制備直徑0.5mm的中性濾紙片，121℃15分種滅菌后保存于干燥環(huán)境。ELISA試劑盒
③ 取上述濾紙片浸入不同血清型的免疫血清后真空凍干, 保存于4℃冰箱備用，使用前以滅菌水濕潤。
(2) 病毒接種
① 用直徑6cm的塑料培養(yǎng)皿培養(yǎng)BHK21或Vero細(xì)胞使成單層。
② 以103PFU/0.2ml被檢藍(lán)舌病病毒接種于細(xì)胞上, 吸附1h。
③ 洗去未被吸附的病毒，棄去洗液。
(3) 覆蓋瓊脂
① 取2倍濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)液加入等量的1.5％瓊脂，每個平皿加入7ml，置平臺冷卻凝固。
② 在瓊脂面上按梅花形圖案放上不同型的血清濾紙片, 并做好記號。
③ 把平皿放置在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天。
④ 真空吸出平皿中的濾紙片。
⑤ 取2倍濃縮的細(xì)胞營養(yǎng)液加入等量的2%瓊脂，每個平皿加入5ml，重新置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天, 待明顯蝕斑抑制環(huán)出現(xiàn)。
(4) 結(jié)果判定 出現(xiàn)明顯抑制蝕斑形成(即濾紙片位置下仍保持活細(xì)胞被染色)的免疫血清即為該被檢病毒的血清型。
注：本試驗方法同時可應(yīng)用于鹿流行性出血病病毒(EHDV) 與藍(lán)舌病病毒(BTV)的鑒別。
3.新城疫病病毒(NDV)分離
(1) 取疑似患病禽的組織用細(xì)胞培養(yǎng)液勻漿,離心沉淀后取上清液。
(2) 用16孔微量培養(yǎng)板制備雞成纖維原代細(xì)胞。
(3) 細(xì)胞長成單層后吸去培養(yǎng)液，向每孔滴加0.1ml被檢病料, 置37℃吸附2小時后棄殘液。
(4) 制備1％瓊脂的BME，置40－50℃水浴待用。
(5) 吸取上述瓊脂加入培養(yǎng)板各孔，每孔0.5ml，使冷卻凝固成覆蓋層。
(6) 把培養(yǎng)板倒置，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。
(7) 制備含0.002％中性紅的1%瓊脂的BME，置40－50℃水浴待用。
(8) 吸取上述瓊脂加入培養(yǎng)板各孔，每孔0.5ml，使冷卻凝固成第二覆蓋層。
(9) 把培養(yǎng)板倒置，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，48小時內(nèi)觀察結(jié)果。
(10) 挑出蝕斑下的細(xì)胞作病毒的進(jìn)一步增殖和鑒定。
注：本試驗方法在樣品中病毒含量少的情況下比單純用細(xì)胞培養(yǎng)分離要敏感。
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