ELISA試劑盒基本原理限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶(水解磷酸二酯鍵)。根據(jù)酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。通常所指的DNA限制性核酸內(nèi)切酶就是Ⅱ型酶。
主要試劑重組質(zhì)粒DNA插入片段300bp本實(shí)驗(yàn)所用限制性核酸內(nèi)切酶為EcoRⅠ，其識(shí)別順序?yàn)椋?′----G↓AATTC----3′3′----CTTAA↑G----5′磷酸二脂鍵斷裂產(chǎn)生5′粘性末端。
1.反應(yīng)體系的建立：⑴在一無(wú)菌1.5mleppendorf管中加入：無(wú)菌雙蒸水7μl10×酶切緩沖液
2μl質(zhì)粒DNA(100ng/μl)10μlEcoRⅠ(5U/μl)1μl總體積為20μl⑵輕輕混勻，12000rpm離心5sec。2.37℃水浴1h。
3.將Eppendorf管置65℃水浴中10min，通過(guò)加熱使酶失活以終止反應(yīng)。
4.12000rpm離心5sec，將管蓋及管壁上的水離下。
5.取10μl消化產(chǎn)物，與2μl6×上樣緩沖液混勻，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)消化效果，電泳條件：約100V30～60min。
6結(jié)果觀察。操作注意事項(xiàng)：
1.吸樣量一定要準(zhǔn)確
2.為了不使酶污染而導(dǎo)致浪費(fèi)，zui后才加酶
3.要求在冰上操作，并充分混勻，
4.開(kāi)啟Eppendorf管時(shí)，手不要接觸到管蓋內(nèi)面，以防污染。
5.樣品在37℃與65℃保溫時(shí)，將離心管蓋嚴(yán)，以防水進(jìn)入管內(nèi)造成實(shí)驗(yàn)失敗。
限制性內(nèi)切酶酶解中常見(jiàn)的問(wèn)題和原因
1.DNA*沒(méi)有被限制性內(nèi)切酶切割：①限制性內(nèi)切酶失活;②DNA不純，含有SDS、有機(jī)溶劑、EDTA等;③非限制性內(nèi)切酶反應(yīng)條件;④酶切位點(diǎn)被修飾;⑤DNA上不存在該酶的識(shí)別順序。
2.DNA切割不*：①限制性內(nèi)切酶活性下降或稀釋不正確;②DNA不純或反應(yīng)條件不佳;③酶切位點(diǎn)被修飾;④部分DNA溶液粘在管壁上;⑤酶切后DNA粘末端退火。
3.DNA片段數(shù)目多于理論值：①限制性內(nèi)切酶星號(hào)活力;②存在第二種限制性內(nèi)切酶污染;③樣品DNA中含有其它DNA。
phospho-BRaf磷酸化B-Raf抗體
BACH2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白BACH2抗體
Bacillusanthracislethalfactor炭疽桿菌致死因子LF抗體
ProteinBOC蛋白BOC抗體
BP1氨肽酶A抗體
BNP腦鈉素/利鈉肽抗體
Bcl-2betaBcl2beta蛋白抗體
Bonesialoprotein骨涎蛋白抗體
Bim細(xì)胞死亡調(diào)解子抗體
BIRC6Apollon凋亡抑制蛋白抗體
BONZO細(xì)胞表面趨化因子受體6抗體
betaendorphinβ-內(nèi)啡肽/βendorphin抗體
ELISA試劑盒
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