白羊草（Bothriochloa ischaemum）為喬本科孔穎草屬多年生叢生禾草，是優(yōu)良的牧草和水土保持植物，其品質(zhì)好、適口性強(qiáng)、覆蓋度大、固土保水能力強(qiáng)，對控制水土流失、維持丘陵山地的生態(tài)平衡具有重要作用[1]。白羊草在世界各暖溫帶都有分布，在我國主要分布于華北和西北的南部、中南區(qū)北部的山區(qū)坡地和黃土高原[2]。目前，白羊草的組織培養(yǎng)再生研究鮮有報道[3-5]。該研究以白羊草的成熟種子為外植體，通過對種子處理與愈傷誘導(dǎo)的篩選，旨在建立一套適宜白羊草成熟種子外植體處理與愈傷組織誘導(dǎo)、分化的組織培養(yǎng)體系，為其再生體系的建立奠定一定的基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步應(yīng)用生物技術(shù)改良白羊草提供技術(shù)平臺。
1材料與方法
1.1試驗材料
供試的白羊草種子于2006年10月采自山西省太谷縣鳳山，海拔1 100 m，植被為喜暖灌草叢類草地，建群種為白羊草，千粒重0.6975 g [6]。
1.2試驗方法
1.2.1白羊草種子的處理。取充分成熟、結(jié)構(gòu)完整的供試白羊草種子，剝?nèi)ネ怙?，先用無菌水浸泡10 min，去除雜質(zhì)并使其沉淀，然后用75%酒精浸泡30 s，期間不斷搖動，用無菌水沖洗3遍，再用0.1 %溶液分別消毒5、10、15、20、25 min，無菌水沖洗4~5次后，用濾紙吸干水漬。然后接種到誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上。
1.2.2愈傷組織的誘導(dǎo)。以MSB（MS無機(jī)鹽+B5有機(jī)成分）為基本培養(yǎng)基，蔗糖濃度30 g/L，瓊脂5 g/L，pH值調(diào)至5.8，每瓶接種25粒，設(shè)3個重復(fù)，接種到附加不同濃度2，4-D（1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 mg/L）的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在黑暗[24 h*黑暗，溫度（25±2）℃]和光照[光照強(qiáng)度2 000~3 000 lx，光周期為16 h/d，溫度（25±2）℃] 2種條件下進(jìn)行培養(yǎng)，35 d后分別統(tǒng)計出芽數(shù)和出愈數(shù)，篩選出白羊草誘導(dǎo)愈傷組織的zui適條件和zui適激素。
1.2.3愈傷組織的繼代改造。25~30 d后將初生愈傷組織從母體上切下，轉(zhuǎn)移至降低2，4-D濃度的改造培養(yǎng)基上，繼代4~5 d，繼代培養(yǎng)基為MSB+1.0 mg/L 2，4-D。
1.2.4愈傷組織的分化。將繼代中結(jié)構(gòu)致密、顆粒狀、鮮黃或嫩黃的胚性組織轉(zhuǎn)至MSB+0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為（25±2）℃，光照強(qiáng)度2 000~3 000 lx，光周期為16 h/d進(jìn)行40~50 d的分化培養(yǎng)，白羊草在分化過程中就有根的產(chǎn)生，待芽長到6~7 cm，根長3~4 cm時轉(zhuǎn)到?jīng)]有激素培養(yǎng)基上壯根。
1.2.5煉苗與移栽。將壯根后的白羊草幼苗進(jìn)行移栽。移栽前先去掉封口膜在培養(yǎng)室中鍛煉2~3 d后，把幼苗基部的殘留瓊脂洗凈，移栽至小盆內(nèi)，移栽基質(zhì)為腐殖質(zhì)、細(xì)沙和菜園土以1∶1∶1混勻配制而成。
1.3數(shù)據(jù)處理
2結(jié)果與分析
2.1種子表面消毒方法的選擇
試驗發(fā)現(xiàn)，用對種子進(jìn)行不同時間（5、10、15、20、25 min）的消毒處理，隨著消毒時間的延長，污染率逐漸降低，出芽率和出愈率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)消毒處理為5~15 min時，出芽率和出愈率逐步上升，到15 min時均達(dá)到峰值，污染率也逐漸降至零；隨著處理時間延長，盡管污染率降低至零，但對種子的儲藏物質(zhì)造成傷害，從而影響芽的產(chǎn)生和愈傷的誘導(dǎo)。因此，酒精浸泡30 s、15 min為消毒方法。
2.2外界條件對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響
由試驗可知，2，4-D濃度在1.0~3.0 mg/L，光照和黑暗條件對白羊草種子發(fā)芽率影響不大。光照條件下2，4-D濃度在4.0 mg/L時，出芽率能達(dá)到100%，在2，4-D濃度為6.0 mg/L時也明顯高于黑暗條件下的出芽率；從發(fā)芽狀態(tài)看，光照條件下，2，4-D各濃度處理的胚芽和胚根都明顯比黑暗條件下增長1~2倍，胚芽長至0.5 cm，胚根達(dá)到9~11 cm。
無論是黑暗條件還是光照條件，都有愈傷出現(xiàn)，但2種條件下誘導(dǎo)差異很大。這種差異主要表現(xiàn)在愈傷狀態(tài)及誘導(dǎo)頻率上。光照條件下的愈傷質(zhì)地較硬，致密，多呈淺黃至深黃，團(tuán)狀，表面干燥，生長迅速；黑暗條件下的愈傷質(zhì)地柔軟，松散，多呈乳白色，團(tuán)狀，表面濕潤，生長相對較慢；黑暗條件下2，4-D各濃度處理的出愈率都明顯高于光照條件；另外，從出愈時間看，2種條件下時間相差1~2 d，差異很小。
會員1.png)