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    研制針對(duì)特殊細(xì)胞系或原代培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基主要有兩種方法。*種方法是找到一個(gè)相關(guān)細(xì)胞類型的培養(yǎng)基已知配方，加入或不加。10％一20％的透析血清，在減少血清的同時(shí)．逐一或成組的改變培養(yǎng)基成分直到培養(yǎng)基達(dá)到所需的條件。這種方法zui初由Ham及其同事采用，通常能提供培養(yǎng)條件。如果發(fā)現(xiàn)一組成分在血清減少時(shí)起到補(bǔ)充的作用，那就通過(guò)單種成分的逐步逐一刪除將活性成分從中篩選出來(lái)，然后尋找其濃度。

    由于*種方法耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，使人們想到了第二種方法，即對(duì)現(xiàn)有培養(yǎng)基，如RPMI1640或DMEM與Ham’s F12的聯(lián)合培養(yǎng)基加以補(bǔ)充，而且將加入成分的種類限制在一個(gè)較小的范圍內(nèi)，僅包括硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白、胰島素、雌激素、三碘甲狀腺原氨酸、乙醇胺、磷酸乙醇胺、生長(zhǎng)因子(EGF、FGF、PDGF、內(nèi)皮生長(zhǎng)添加物等)、前列腺素(PGE1、PGF2a)和其他有特殊功能的物質(zhì)。通常對(duì)多數(shù)細(xì)胞而言，硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素都很重要，但對(duì)其他成分的需求則差別較大。

1)無(wú)血清培養(yǎng)基的制備

    使用無(wú)血清培養(yǎng)的時(shí)間還不長(zhǎng)，*通用的無(wú)血清培養(yǎng)基還處在研究階段，然而已開(kāi)始有商品供選擇，如MCDB、Ultroser系列無(wú)血清培養(yǎng)基等。

    以Ultroser G為例，它包括有生長(zhǎng)因子、附著因子、微量元素、激素、連接素、維生素6種物質(zhì)；此外還含有抑制胰蛋白酶因子，便于用胰蛋白酶?jìng)鞔?。ultroser G為凍干制品，溶解后可用微孔濾膜過(guò)濾除菌，儲(chǔ)存于4℃；它的刺激生長(zhǎng)作用相當(dāng)于胎牛血清的5倍。

    其他類型的無(wú)血清培養(yǎng)基在不斷問(wèn)世。如MEM Iscow!也是一種較好的粉劑無(wú)血清培養(yǎng)基，在MEM的基礎(chǔ)上外加有轉(zhuǎn)鐵白蛋白、牛血清蛋白和黃豆脂質(zhì)(Soybean Lipids)。毫無(wú)疑問(wèn)，無(wú)血清培養(yǎng)基有很大的實(shí)用價(jià)值，而且是可行的，一定會(huì)得到更進(jìn)一步的發(fā)展。

    但由于當(dāng)前缺少?gòu)V泛使用的定型無(wú)血清產(chǎn)品，在所需附加物有限的情況下，也可自行配制無(wú)血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)用的細(xì)胞外基質(zhì)(EcM)有時(shí)可以直接加入培養(yǎng)基內(nèi)，但更常用的是使ECM貼附在細(xì)胞生長(zhǎng)底物表面，生長(zhǎng)表面用玻璃或是無(wú)毒的塑料材料均可。配制時(shí)要用超純的試劑和水，小心配制含Ca 2+ 、Fe 2+或Fe 3+的溶液，防止產(chǎn)生沉淀。在堿性pH條件和有磷酸鹽存在的時(shí)候，金屬鹽溶液會(huì)產(chǎn)生沉淀，特別是在培養(yǎng)基或鹽溶液經(jīng)過(guò)高壓滅菌后更易產(chǎn)生，所以儲(chǔ)存液中的陽(yáng)離子必須保存在低pH條件下(低于6．5)，并且保證無(wú)磷酸鹽的存在。溶液必須經(jīng)過(guò)高壓滅菌或過(guò)濾消毒。通常的方法是I臨用培養(yǎng)基之前再加陽(yáng)離子，或者將各種組分配制成一系列的儲(chǔ)存液，如：1 000x的礦物質(zhì)和維生素，50x的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸溶解于0．1 mol／L HCl中，100x的必需氨基酸溶解于水中，lOx的鹽溶解于水中，還有其他的特殊輔助因子、脂類等配制成1 000X溶液。這些成分要按照正確的比例配制并稀釋到zui終的濃度，然后檢測(cè)pH和滲透壓。

制備過(guò)程要在嚴(yán)格無(wú)菌條件下進(jìn)行，具體制備程序如下：

①選擇適宜的培養(yǎng)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，按上述條件先配制儲(chǔ)存母液。

②使用前，儲(chǔ)存母液用高純度的蒸餾水稀釋成O．1 mg／mL濃度的使用液。

③使用液用0．22 μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾除菌。

④用吸管吸取使用液，均勻涂于消毒滅菌的細(xì)胞培養(yǎng)器皿的細(xì)胞生長(zhǎng)表面。使用液的用量可按每cm2表面加50止的溶液，為保證其表面全部被溶液浸濕，用量可適當(dāng)增減。

⑤室溫下靜置5 min(使用膠原做基質(zhì)時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間至24 h)，然后吸出多余的溶液。

⑥用滅菌蒸餾水(100μL／cm2)洗滌涂有ECM的表面，然后將水分盡量吸凈控干。

⑦根據(jù)不同細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)，接種適宜濃度的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。