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技術(shù)文章
SMART法的原理與技術(shù)流程
閱讀：5179 發(fā)布時(shí)間：2015-11-20真核細(xì)胞的mRNA 在加工過程中有一個(gè)比喻為“穿鞋戴帽"的過程,因此mRNA的3′末端都帶有一段Poly A,這是利用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA文庫的基礎(chǔ)。但是由于cDNA的5′端的序列各不相同,如何獲得全長(zhǎng)的cDNA,如何擴(kuò)增由微量的mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA文庫,如何利用已知片段序列得到全長(zhǎng)的cDNA (即RACE) ,曾經(jīng)是令人困擾的問題。常見的做法是在合成cDNA的雙鏈后在兩端連上接頭,利用已知的接頭序列再進(jìn)行擴(kuò)增,或者是利用末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈cDNA的3′末端加上一連串的G或者C (或者A /T) ,再通過補(bǔ)齊粘末端,利用已知的兩頭序列進(jìn)行擴(kuò)增。但是,這些方法在不同程度上存在一些問題,比如接頭的連接效率非常有限,會(huì)導(dǎo)致部分信息的丟失,再加上這些方法需要多次用不同的酶處理有限的樣品,需要經(jīng)過反復(fù)的純化,會(huì)損失很多有用的信息,特別是少量樣品中的低豐度信息,很大程度上會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外,由于mRNA容易部分降解,很難確定得到的cDNA 是否就是全長(zhǎng)的cDNA,還是cDNA的片段。
SMART技術(shù)的出現(xiàn)是一個(gè)新的里程碑。SMART技術(shù)是利用逆轉(zhuǎn)錄酶內(nèi)源的末端轉(zhuǎn)移酶活性,只要單管,一步即可完成,不需要額外的cDNA抽提純化,或者額外的酶反應(yīng),只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高質(zhì)量、高產(chǎn)量的cDNA文庫,更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度,可以應(yīng)用于直接擴(kuò)增基因、構(gòu)建cDNA文庫、用已知序列釣全長(zhǎng)cDNA (RACE) ,以及用于芯片檢測(cè)的cDNA探針的擴(kuò)增等。細(xì)胞
1、SMART法的原理
SMART技術(shù)的全稱是Switching Mechanism At 5′end of the RNA Transcrip t,其名稱反映了該技術(shù)的精髓,它充分利用了反轉(zhuǎn)錄酶Powerscrip t TM RT和限制性內(nèi)切酶Sfi I的特性(流程如圖1 ) 。該方法中全長(zhǎng)cDNA的獲得是借助Powerscrip t TM RT的末端轉(zhuǎn)移酶活性來實(shí)現(xiàn)的。此外,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí),在cDNA*、二鏈引物的5′端引入了sfiI(A)和Sfi I(B)位點(diǎn),因此只需對(duì)目的cDNA進(jìn)行單酶切( Sfi I酶切) ,即可實(shí)現(xiàn)對(duì)其定向克隆。
2、SMART技術(shù)流程
與普通的建立cDNA文庫方法相比, SMART技術(shù)的不同主要包括三個(gè)方面的內(nèi)容:
(1)mRNA的制備:從總RNA 中純化mRNA 的方法是Oligo ( dT) 2纖維素柱層析法。總RNA 通過柱時(shí),mRNA3′端poly(A)與纖維素上連接的Oligo ( dT)鏈結(jié)合而吸附于柱上,從而被分離出來。
( 2) cDNA *鏈的合成:在合成cDNA 的反應(yīng)中事先加入的3′末端帶Oligo ( dG)的SMART引物,以O(shè)ligo ( dT) 12218為引物,mRNA模板在到達(dá)mRNA的5′末端時(shí)碰到真核mRNA*的“帽子結(jié)構(gòu)",即甲基化的G時(shí)會(huì)連續(xù)在合成的cDNA末端加上幾個(gè)( dC) , SMART引物的Oligo ( dG)與合成cDNA末端突出的幾個(gè)C配對(duì)后形成cDNA的延伸模板,逆轉(zhuǎn)錄酶會(huì)自動(dòng)轉(zhuǎn)換模板,以SMART引物作為延伸模板繼續(xù)延伸cDNA 單鏈直到引物的末端。細(xì)胞
(3)通過長(zhǎng)距離PCR (LD - PCR)擴(kuò)增cDNA:以事先加入的3′末端帶Oligo ( dG)的SMART引物為5′端引物,以*鏈3′末端Oligo ( dT) 12～18引物的互補(bǔ)序列為3′端引物,在DNA聚合酶的催化下,互補(bǔ)合成cDNA的第二鏈;合成第二鏈后可以利用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。由于有5′帽子結(jié)構(gòu)的mRNA 才能利用這個(gè)反應(yīng)得到能擴(kuò)增的cDNA,擴(kuò)增得到的cDNA就是全長(zhǎng)cDNA,且使全長(zhǎng)cDNA得到大量的復(fù)制和擴(kuò)增,因此可消除基因組DNA和無poly(A)的RNA,并且允許用很微量的總RNA或mRNA構(gòu)建高比例全長(zhǎng)cDNA。