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病毒致病機(jī)制Z常用的方法
閱讀：1120 發(fā)布時(shí)間：2015-11-18病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖，首先要進(jìn)到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)合成大量子代病毒，再釋放到細(xì)胞外。此過(guò)程一般要經(jīng)過(guò)吸附、穿人、脫殼、生物合成、裝配與釋放5個(gè)階段，又稱復(fù)制周期。經(jīng)過(guò)病毒復(fù)制，宿主細(xì)胞發(fā)生變化。吸附是病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合階段，是構(gòu)成感染的*步。
一、材料
1．細(xì)胞24孔培養(yǎng)板MAl04細(xì)胞單層。
2．病毒輪狀病毒，濃度為l00TCD。
3．細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI 1640培養(yǎng)液。
4．TKS緩沖液 10mmol／L Tris—HCl，O．9％NaCl pH8．2。
5．Hank’s液。
二、方法
1．可溶性輪狀病毒受體制備大量培養(yǎng)的MAl04細(xì)胞，用11強(qiáng)洗2次，按lO7個(gè)／甜細(xì)胞濃度溶于1％NP一40的TBS緩沖液中，置4℃1h并每15m|n搖動(dòng)搖1次，4℃3500r／min離心5分鐘，吸上清液于一70℃速凍，即為MAl04細(xì)胞可溶性受體。再經(jīng)飽和硫酸銨沉淀及免疫親和層析法純化．即為純化受體蛋白。
2．受體蛋白免疫血清制備取BALB／C小鼠多只，皮下多位點(diǎn)注射純化受體蛋白，每位點(diǎn)4μg。于第2、3、5、6周每只鼠經(jīng)尾靜脈加強(qiáng)注射受體蛋白4μg，第7周眼內(nèi)眥靜脈取血分離血清，即為受體免疫血清。
3．細(xì)胞保護(hù)性試驗(yàn)將MAl04細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板，待細(xì)胞成層后，用Hank’s液將細(xì)胞洗2次，加入RPMIl640液3倍稀釋的受體免疫血清，每孔O．1ml，共4孔，同時(shí)設(shè)3種對(duì)照，即正常細(xì)胞、正常鼠血清及病毒對(duì)照，每對(duì)照4孔。于37℃作用1h后，各iL均用Hank’s液洗3次，并加入胰蛋白酶預(yù)處理的輪狀病毒，每孔O．1ml，于37℃作用1h后，加維持液至1ml，37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)24～一48h逐日觀察CPE。
三、結(jié)果分析
分析接種病毒24～48h后MAl04細(xì)胞cPE情況。如果正常鼠血清對(duì)照CPE為+++～++++；免疫血清實(shí)驗(yàn)組CPE為一或±；單純病毒對(duì)照孔為+++～++++時(shí)，即說(shuō)明受體免疫血清起到保護(hù)作用，可以阻斷病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合，而使病毒不感染宿主細(xì)胞。