當培養(yǎng)吼或培養(yǎng)瓶內(nèi)的內(nèi)皮細胞形成致密的單層時，應(yīng)進行傳代，否則對細胞生長不利。步驟如下：
1．洗滌細胞PBS洗滌細胞2次。
2．消化細胞加入O．05％*溶液1ml消化單層細胞，鏡下可見細胞立即變圓、收縮。棄去*，利用培養(yǎng)瓶內(nèi)殘余*進行消化。當觀察到大部分細胞脫落或漂浮起來時加入培養(yǎng)液，終止*的消化作用。
3．培養(yǎng)細胞用滴管吹打壁上的細胞，使其*脫離和分離。按l：2的比例接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。
一、結(jié)果分析
通過培養(yǎng)可獲得生長良好的內(nèi)皮細胞，可用下述方法對其進行鑒定。
1．光鏡觀察倒置相差顯微鏡下可見內(nèi)皮細胞呈菱形或多角形，融合成片后可形成鵝卵石狀鑲嵌排列。
2．電鏡觀察剛貼壁的內(nèi)皮細胞呈長多角形，并向四周伸向細長的突起，融合成片后細胞呈多角形。細胞表面有微絨毛，也有的細胞質(zhì)膜凹陷。胞核呈橢圓形，個別稍凹陷·核仁明顯。細胞之間具有間隙，伸出突起相連。位于邊緣的細胞呈收縮狀態(tài)，胞體*微絨毛收縮成小泡狀。
3．因子Ⅷ相關(guān)抗原免疫熒光檢測 由于因子Ⅷ只存在于內(nèi)皮細胞、巨核細胞和血小板中，故因子Ⅷ相關(guān)抗原是鑒定體外培養(yǎng)內(nèi)皮細胞zui可靠的標志。操作步驟如下：
(1)固定內(nèi)皮細胞：內(nèi)皮細胞用PBS沖洗干凈，放人乙醇一丙酮混合液(1：1)中固定10min，在空氣中自然干燥。
(2)加入抗體：加入因子Ⅷ相關(guān)抗原抗血清(如兔抗人因子Ⅷ相關(guān)抗原抗血清)，37℃孵育lh。用PBS沖洗干凈，晾干，再加抗*動物IgG熒光抗體(如羊抗兔IgG熒光抗體)，37℃孵育30min。PBS沖洗，晾干。
(3)封片：用緩沖甘油封片。
(4)觀察：將片子置熒光顯微鏡下觀察，內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)呈較強的黃綠色熒光，胞核周圍尤其明顯。
二、細胞凍存與復蘇
(一)細胞凍存
內(nèi)皮細胞生長到一定數(shù)量時可用液氮凍存?zhèn)溆谩２襟E如下：
1．洗滌細胞 在*消化下來的細胞中加入少量培養(yǎng)液，離心(1000r／min，10min)，吸去上清液。
2．凍存細胞向洗滌過的細胞內(nèi)加入凍存液(含10％DMSO的培養(yǎng)液)，使細胞濃度約為l×106／ml。將其分裝于細胞凍存管中，每管1ml。把凍存管放至70℃冰箱中過夜，再將凍存管放入液氮中凍存。
(二)細胞復蘇
1．融化凍存的細胞從液氮中取出凍存管，迅速放入37℃水浴中并不斷振搖，使其快速融化：
2．洗滌細胞將凍存管離心(1000r／min，10min)，吸去上清液，以去除DMSO。
3．培養(yǎng)細胞向凍存管內(nèi)加入1ml培養(yǎng)液，吹打細胞沉淀以獲得細胞懸液，移人培養(yǎng)瓶內(nèi)，再加入．4ml培養(yǎng)液，使細胞濃度為3×lO5／ml。
