elisa試劑盒染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)實驗原理 基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的 蛋白結(jié)合的 DN段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA 相互作用的信息。CHIP 不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與 DNA 的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關(guān)系。而且，CHIP 與其他方法的結(jié)合，擴大了其應(yīng)用范圍：CH [ChIP 染色質(zhì) 免疫共沉淀 細(xì)胞蛋白質(zhì) 抗體] 實驗原理 基 本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋 白結(jié)合的 DN段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA 相互作用的信息。CHIP 不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與 DNA 的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關(guān)系。而且，CHIP 與其他方法的結(jié)合，擴大了其應(yīng)用范圍：CHIP 與基因芯片相結(jié)合建立的CHIP-on- chip 方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點；RNA-CHIP 用于研究 RNA 在基因表達調(diào)控中的作用。由此可見，隨著 CHIP 的進一步完善，它必將會在基因表達調(diào)控研究中發(fā)揮越來越重要的作用。 實驗試劑 1. 37% 甲醛 2. * 3. PBS 4. 蛋白酶抑制劑 （protease inhibitor） 5. RnaseA 6. 0.5MEDTA 7. 1MTris.HCl（PH6.5） 8. 10 mg/ml 蛋白酶 K 等。 實驗設(shè)備 1. 10 cm 平皿 2. 水浴鍋 3. 細(xì)胞 4. 超聲破碎儀 5. 15 ml 離心管 6. 高速離心機 7. 交聯(lián)儀等。 實驗材料 培養(yǎng)好的細(xì)胞 實驗步驟 1. 細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎 （天） 1） 取出 1 平皿細(xì)胞（10 cm 平皿），加入 243 ul 37% 甲醛，使得甲醛的終濃度為 1%（培養(yǎng)基共有 9 ml）。 2） 37 攝氏度孵育 10 min. 3） 終止交聯(lián)：加*至終濃度為 0.125M.450 ul 2.5M *于平皿中。混勻后，在室溫下放置 5 min 即可。 4） 吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 次。 5） 細(xì)胞收集細(xì)胞于 15 ml 離心管中（PBS 依次為 5 ml,3 ml 和 3 ml）。預(yù)冷后 2000rpm 5 min 收集細(xì)胞。 6） 倒去上清。按照細(xì)胞量，加入 SDS Lysis Buffer.使得細(xì)胞終濃度為每 200ul 含 2×106 個細(xì)胞。這樣每 100ul溶液含 1×106 個細(xì)胞。再加入蛋白酶抑制劑 （protease inhibitor） 復(fù)合物。假設(shè) MCF7 長滿板為 5×106個細(xì)胞。本次細(xì)胞長得約為 80%.即為 4×106 個細(xì)胞。因此每管加入 400ul Lysis Buffer.將 2 管混在一起，共 800ul. 7） 超聲破碎：VCX750,25% 功率，4.5S 沖擊，9S 間隙。共 14 次。 2. 除雜及抗體哺育 （天） 1） 超聲破碎結(jié)束后，10,000 g 4 度離心 10 min.去除不溶物質(zhì)。留取 300ul 做實驗，其余保存于-80 度。300ul中，100ul 加抗體做為實驗組；100ul 不加抗體做為對照組；100ul 加入 4ul5MNaCl（NaCl 終濃度為 0.2M），65度處理 3 h 解交聯(lián)，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。 2） 在 100ul 的超聲破碎產(chǎn)物中，加入 900ulChIPDilutionBuffer 和 20ul 的 50×PIC。再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA.4 度顛轉(zhuǎn)混勻 1 h. 3） 1 h 后，在 4 攝氏度靜置 10 min 沉淀，700rpm 離心 1 min. 4） 取上清。各留取 20ul 做為 input.一管中加入 1ul 抗體，另一管中則不加抗體。4 度顛轉(zhuǎn)過夜。 3. 檢驗超聲破碎的效果 （天） 取 100ul 超聲破碎后產(chǎn)物，加入 4ul5MNaCl,65 度處理 2 h 解交聯(lián)。分出一半用酚/抽提。電泳檢測超聲效果。 4. 免疫復(fù)合物的沉淀及清洗 （第二天） 1） 孵育過夜后，每管中加入 elisa試劑盒60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA.4 度顛轉(zhuǎn) 2 h. 2） 4 度靜置 10 min 后，700rpm 離心 1 min.除去上清。 3） 依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物。清洗的步驟：加入溶液，在 4 度顛轉(zhuǎn) 10 min,4 度靜置 10 min 沉淀，700rpm 離心 1 min,除去上清。 洗滌溶液： a. 低鹽溶液一次 b. 高鹽溶液一次 c. LiCl 溶液一次 d. TE buffer 兩次 4） 清洗完畢后，開始洗脫。洗脫液的配方：100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共 1 ml。每管加入250ul 洗脫 buffer,室溫下顛轉(zhuǎn) 15 min,靜置離心后，收集上清。重復(fù)洗滌一次。zui終的洗脫液為每管 500ul. 5） 解交聯(lián)：每管中加入 20ul 5M NaCl（NaCl 終濃度為 0.2M）?；靹?，65 度解交聯(lián)過夜。 5. DNA 樣品的回收 （第三天） 1） 解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入 1ulRNaseA（MBI），37 度孵育 1 h. 2） 每管加入 10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl（PH6.5），2ul10 mg/ml 蛋白酶 K。45 度處理 2 h. 3） DNA 片段的回收-omega 膠回收試劑盒。zui終的樣品溶于 100ulddH2O. 6. PCR 分析 （第三天） ChIP- chip 技術(shù)對于大規(guī)模挖掘順式調(diào)控信息成績，同時它可以用于胚胎干細(xì)胞和一些疾病如癌癥（cancer）、心血管疾病和*神經(jīng)紊亂的發(fā)生的機制。 研究人員還可以利用這項技術(shù)開發(fā)一些治療方法。目前 ChIP-chip技術(shù)研究主要集中于兩個領(lǐng)域：及轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和條件特異性；組蛋白的修飾，組蛋白 修飾蛋白和染色體重建。 ChIP-chip 在描述轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子動力學(xué)中的研究、染色體結(jié)構(gòu)組分的分布、在組蛋白的修飾、組蛋白修飾蛋白和染色體重建中的應(yīng)用也十分廣泛。ChIP-chip 技術(shù)的優(yōu)點是，可以在體內(nèi)進行反應(yīng)；在給定的檢驗細(xì)胞環(huán)境的模式下得到 DNA相互關(guān)系的簡單影像；使用特異性修正抗體鑒定與包含有一個特異性后轉(zhuǎn)錄修正的蛋白質(zhì)的相關(guān)位點；直接或者間接（通過蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用）的鑒別基因組與蛋白質(zhì)的相關(guān)位點。缺點是：需要一個特異性蛋白質(zhì)抗體，有時難于獲得；為 了獲得高豐度的結(jié)合片段，必須實驗演示胞內(nèi)條件下靶標(biāo)蛋白質(zhì)的表達情況；調(diào)控蛋白質(zhì)的基因的獲取可能需要限制在組織來源中。elisa試劑盒 總之，ChIP-chip 技術(shù)的發(fā)展為析活細(xì)胞或組織中 DNA 與蛋白質(zhì)的相互關(guān)系提供了一個極為有力的工具。在未來的研究中，將對芯片的構(gòu)建進行改進，提高其實用性。使用易于獲得抗體，增加這種方法的可用性。
