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動物實驗樣本前期處理方法解析

閱讀:892發(fā)布時間:2016-3-3

    在Elisa試劑盒發(fā)展的過程中,樣本前處理技術(shù)一直沒有受到重視,相對與現(xiàn)代分析技術(shù)的快速發(fā)展,樣本前處理技術(shù)以及儀器的發(fā)展滯后并制約了分析化學(xué)的發(fā)展,在過去的很多年中,分析化學(xué)的發(fā)展集中在研究分析方法的本身:如何提高Elisa靈敏度、選擇性以及分析速度;如何應(yīng)用物理、化學(xué)、生物學(xué)等方面的理論來發(fā)展新的分析方法與技術(shù),以滿足新技術(shù)對分析化學(xué)提出的新目標與高要求;如何采用新技術(shù)的成果改進分析儀器的性能、速度、以及自動化的程度。長期以來忽視對前處理方法與技術(shù)的研究,是樣本前處理技術(shù)成為制約分析化學(xué)發(fā)展的瓶頸。

一、勻漿介質(zhì)的制備:

    一般采用pH 7.4, 0.01mol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA-2Na, 0.01mol/L蔗糖,0.8%氯化鈉溶液或直接用0.86%的生理鹽水作為勻漿介質(zhì)。

二、組織勻漿的制備

1、取組織塊(0.1g~0.2g)zui少可到2~5mg在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,準確稱重,放入5ml的勻漿管中。

2、按重量(g):體積(ml)=1:9的比例加入9倍體積的勻漿介質(zhì)(pH7.4, 0.01mol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA-2Na ,0.01mol/L蔗糖,0.8%的氯化鈉溶液)或者0.86%的生理鹽水于勻漿管中,冰水浴條件下,用眼科小剪盡快剪碎組織塊。

3、勻漿的方式有多種:手工勻漿,機器勻漿,超聲粉碎。

① 手工勻漿:左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手將搗桿垂直插入套管中,上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次(6~8分鐘),充分研碎,制成10%的勻漿液。

② 機器勻漿:用組織搗碎機10000~15000 轉(zhuǎn)/分 上下研磨制成10%組織勻漿,也可用內(nèi)切式組織勻漿機制備(勻漿時間10秒/次,間隙30秒,連續(xù)3~5次,在冰水中進行),皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時間。

③ 超聲粉碎:用超聲粉碎機進行粉碎,可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎,也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀,用400安培,5秒/次,間隙10秒反復(fù)3~5次。

鏡檢觀察:取少量組織勻漿作涂片(直接涂片、染色均可以),顯微鏡下觀察細胞是否破碎,若沒有則可延長勻漿時間。

4、將制備好的10%勻漿液用普通離心機或低溫低速離心機2500轉(zhuǎn)/分左右,離心10~15分鐘,取上清液進行測定.

三、樣本保存:

    動物組織樣本暫時不測定,可立即低溫凍存,溫度越低越好,中間如*凍融,-20℃以下可保存三個月,-70℃以下可保存六個月。

    制備好的勻漿液建議不要凍存,當(dāng)天進行測定,如放置時間過長相關(guān)酶活會有所下降,部分指標4℃可存放3~5天(如SOD要存放2~3天,MDA可存放3~5,總蛋白測定可存5~7天等)。

    對臨床檢驗ELISA測定中出現(xiàn)的假陽性或假陰性結(jié)果,要從多方面進行分析除試劑因素和操作因素之外,更多的應(yīng)從標本因素方面進行分析,并采取相應(yīng)措施排除干擾作用。


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