2b-RAD基因分型樣品的制備
實(shí)驗(yàn)試劑
ALFI（(Fermentas, cat no. ER1801）
T4連接酶（NEB, cat no. M0202）
ATP（NEB, cat no. P0756）
DNA聚合酶（(NEB, cat no. M0530）
dNTP（NEB, cat no. N0447）
瓊脂糖
所有的連接子和寡核苷酸引物購(gòu)于 IDT。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 酶切
1) 準(zhǔn)備完整，高質(zhì)量的基因組DNA樣本，每個(gè)樣本含量為1µg，在高濃度(至少250 ng µl-1)。用無(wú)核酸水稀釋所有樣品至相同體積(4μL)。
2) 通過(guò)將以下物質(zhì)加入一個(gè)試管中混合，獲得酶切混合物。這里所指體積為單一一個(gè)反應(yīng)的體積，因此乘以樣本數(shù)，再多加上一些避免吸取導(dǎo)致的誤差。
0.6μL 10×緩沖R
0.4μL 150μM的SAM
1.0 U AlfI
加入無(wú)核酸水(NFW)至總體積2.0 µl
3) 將 2μL酶切混合物與 4μL DNA樣品混合，并在37°C孵育1小時(shí)，然后在65℃滅活酶20分鐘，保持樣本在冰上。
2. 接頭連接
1) 準(zhǔn)備2份雙鏈接頭，都用終濃度為4μM的寡核苷酸綁定，通過(guò)SLD- ada1-ALFI和反SLD- ada1連接準(zhǔn)備接頭1，通過(guò)SLD- ada 2 AlfI和反SLD- ada2相連接準(zhǔn)備接頭2。
2) 將下列物質(zhì)混合在一個(gè)試管中來(lái)制備連接混合物，這里列出的體積為單一一個(gè)的反應(yīng)體積，因此根據(jù)需要擴(kuò)充體積。
0.5μL 10 mM ATP
2.0μL 10× T4連接酶緩沖液
2.5μL 5μM的接頭1
2.5μL 5μM 的接頭2
11.5μL NFW
3) 將5μL消化的DNA與20μL酶切混合物混合。孵育1小時(shí)(熱滅活酶，16°C如ALFI，或未滅活酶，4°Ç，如BsaXI)，放置冰上。
條形碼插入
1預(yù)試PCR確定zui低循環(huán)數(shù)，并評(píng)估樣品的相對(duì)產(chǎn)量。通過(guò)以下成分混合在一個(gè)試管內(nèi)準(zhǔn)備一份PCR酶切混合物。這里列出的體積為單一一個(gè)的反應(yīng)體積，因此根據(jù)需要擴(kuò)充體積。
6.5μL NFW
2.5μL 2.5 mM dNTP
0.4μL 10μM SLD-P5
0.4μL 10μM SLD-P6
1.0μL 1μM SLD-P3
1.0μL 1μM SLD-P4 (條碼碼)
4.0μL 5× HF緩沖區(qū)
0.2μ 聚合酶
2) 每個(gè)樣本將16μL酶切混合物與4μL接頭子混合，應(yīng)用以下程序：(98℃ 5秒，60℃ 20秒，72℃10秒) × 12個(gè)循環(huán)。
3) 每個(gè)反應(yīng)5μL樣品，兩個(gè)循環(huán)時(shí)間間隔(N = 6，8，10，及12個(gè)循環(huán))。每個(gè)采樣間隔期間，可以暫停熱循環(huán)。
4) 凝膠電泳(2％瓊脂糖TBE緩沖凝膠)檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，使用小分子量的 marker。要求PCR產(chǎn)物大小?130 bp，選擇循環(huán)的zui低數(shù)。
5) 通過(guò)將以下成分混合來(lái)準(zhǔn)備PCR反應(yīng)的酶切混合物。這里列出的體積為單一一個(gè)的反應(yīng)體積，因此根據(jù)需要擴(kuò)充體積。
32.5μL NFW
12.5μL 2.5μM dNTP
2.0μL 10μM SLD-P5
2.0μL 10μM SLD-P6
5.0μL 1μMSLD-P3
5.0μL 1μMSLD-P4(條形碼)
20.0μL 5×HF緩沖液
1.0μ 聚合酶
6) 將80μL酶切混合物與20μL接頭子混合，并根據(jù)第4步確定使用循環(huán)次數(shù)擴(kuò)增。
凝膠純化
1) 2％??瓊脂糖凝膠，使用標(biāo)準(zhǔn)的電泳方法和標(biāo)記物。
2) 設(shè)置紫外透射為低強(qiáng)度，觀察目標(biāo)條帶(?130 BP)，限制每個(gè)樣品的紫外照射不超過(guò)30秒。
3) 從凝膠中切下所得條帶，準(zhǔn)備提?。?/p>
a. 根據(jù)你所選擇的膠提取試劑盒，根據(jù)說(shuō)明提取
b. 將膠直接放入水中洗脫(1.5 ml離心管中40μL NFW)，在4°C過(guò)夜，到第二天早上收集洗脫液。
4) 從每個(gè)準(zhǔn)備液和混合液中收集小片段(2-10µl)，然后測(cè)序。剩下的準(zhǔn)備液可以20°C保存6個(gè)月。
會(huì)員1.png)