Marker的相關疑問
MM.我用的是可視marker（BIO_RAD），但是電泳總跑不全8條帶，請問什么原因？怎樣改善？膠用過8％，10％，12％，都是這樣。marker是新買的。
解答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時間試試看。當然梯度膠也是不錯的選擇。
NN.用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開始做Western Blot時還能夠看到marker，當然也僅能看見其中zui多三條帶。用80V進行SDS-PAGE電泳，用恒壓10V45min轉印的。前幾次做Western Blot時沒有進行麗春紅染色，但盡管用了此方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現(xiàn)。再就是把70KD和130KD兩個目的蛋白同時在一塊膠上進行分析，用培養(yǎng)基樣品進行分析，沒有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯(lián)抗體（Anti-V5-HRP）。但就是出不來結果，我很茫然。謝謝您過給予指點！
解答：1、“我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開始做Western Blot時還能夠看到marker，當然也僅能看見其中zui多三條帶。”有的時候，Prestained Marker 放久了效果就會變差，電泳是條帶不清晰，擴散。但是你的問題可能還有其他的方面的問題，可能是蛋白跟膜結合的不緊密。轉移是多加點甲醇。
2、“前幾次做Western Blot時沒有進行麗春紅染色，但盡管用了此方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現(xiàn)。”轉移時半干法建議用恒流，你這樣的也就30kd-50kd的轉移地比較好。
3、“再就是把70KD和130KD兩個目的蛋白同時在一塊膠上進行分析，用培養(yǎng)基樣品進行分析，沒有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯(lián)抗體（Anti-V5-HRP）。”
是否檢測了表達量，二抗是否是好的，你做了陽性對照？你要做這么大的蛋白轉移時間延長到1.5hrs。
