Western blot 實驗注意事項
一． 蛋白樣品的制備 1. 組織樣品的制備 ： 按組織凈重（g）：裂解液體積（ml）=1:10 的比例加入相應(yīng)體積的裂解液（加入 PMSF 使其終濃度為 1mM，適當(dāng)濃度的蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑以免內(nèi)源性酶 分解蛋白，影響蛋白質(zhì)的抽提）進(jìn)行勻漿。 蛋白質(zhì)的樣品制備是 western blotting 的*步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求可 得獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題： 1. 在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的zui大溶解性和可重復(fù)性。 2. 選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價 二硫鍵，使其形成各自多肽的溶液。 3. 盡量去除核酸，多糖，脂類等分子的干擾，在裂解完畢離心之后小心取中層澄清 溶液，注意不要吸到底層沉淀和上層脂類。 4. 防止蛋白在處理過程中的人為修飾，制備過程必須在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破 碎釋放出得各種酶類的修飾。（可以加入 PMSF 等酶抑制劑） 5. 樣本制備完后分裝保存，但是注意不要反復(fù)凍融 二． 凝膠的制備 均一膠的制備，分子量較小的蛋白選用較大濃度的凝膠。 30%的 PAG 配置完后過濾四度保存。10%sds 室溫保存。AP 不穩(wěn)定，用時現(xiàn)配。 制膠關(guān)鍵是聚合時間，分離膠聚合控制在從加入 10%AP 和 TEMED 起至開始凝膠的時 間為 10-20min（未*凝聚）。濃縮膠聚合時間為 8-10min 開始聚合?？赏ㄟ^控 制 AP 和 TEMED 量來控制。AP，TEMED 的量過高，局部膠凝的太快，會使凝膠不均勻， 電泳蛋白條帶會彎曲。環(huán)境溫度較高時，應(yīng)減少 AP，TEMED 的量。 空氣中氧氣會影 響膠的聚合，所以在分離膠上面應(yīng)加一層水或正丁醇以隔絕氧氣。 三． 電泳常見問題： 1. 條帶出現(xiàn) “微笑”現(xiàn)象（中間凹兩邊翹起）：主要是凝膠中間部分凝固不均所致， 應(yīng)待凝膠充分凝固后電泳，或者催化劑加入后沒充分混勻。 2. 條帶出現(xiàn)“皺眉”現(xiàn)象（中間鼓坡兩邊向下）：兩玻璃板之間底部氣泡所致，應(yīng)排 除底部氣泡。 3. 帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象：主要是樣本溶解效果不佳；分離膠濃度過大，電泳緩沖液放置 時間過長。建議：加樣前離心，選擇適當(dāng)?shù)臉颖揪彌_液，加適量的樣品促溶劑； 使用新配置的電泳緩沖液，降低凝膠濃度或使用梯度凝膠。 4. 蛋白條帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象：樣品不溶性顆粒引起的：加樣前離心，加入適量的促溶 劑 5. 指示的溴酚藍(lán)已跑出底板，但蛋白質(zhì)未跑下來：與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。 更換正確的 PH 值的緩沖液，降低凝膠濃度或使用梯度凝膠 四． 轉(zhuǎn)印 濕式電轉(zhuǎn)印 2 轉(zhuǎn)膜注意事項：轉(zhuǎn)移緩沖液，膜的選擇至關(guān)重要 1. 要使蛋白質(zhì)組分能有效的從凝膠轉(zhuǎn)移到固相紙膜上，緩沖液的 PH 值很重要。有 些分子量不是很大的蛋白質(zhì)區(qū)帶，即使延長電轉(zhuǎn)印時間也不能從凝膠轉(zhuǎn)移到膜 上。這是由于蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)移緩沖液中恰好處于等電點狀態(tài)造成的，因此應(yīng)適當(dāng) 改變轉(zhuǎn)移緩沖液的 PH 以利于轉(zhuǎn)膜。另外對于分子量較小的蛋白質(zhì)，可在緩沖 液中加入適量甲醇，因為甲醇能促進(jìn)它們固定在固相膜上。但是對于大分子量 的蛋白質(zhì)，尤其是堿性蛋白質(zhì)緩沖液中是不宜加入甲醇的，因為甲醇使凝膠孔 徑變小，不利于分子量較大的蛋白的轉(zhuǎn)移，；甲醇能將結(jié)合在堿性蛋白質(zhì)上的 SDS 解離出來而使其帶正電或呈電中性，蛋白質(zhì)就更難從凝膠中轉(zhuǎn)移出來。 2. 電轉(zhuǎn)印膜的選擇：有 NC 膜，重氮化膜和陽離子尼龍膜，PVDF 膜。其中 NC 膜 使用的zui為普遍，它的蛋白質(zhì)容量大，可用各種染色方法進(jìn)行檢測，但是它與 蛋白質(zhì)的結(jié)合是非共價性的，膜干燥后很脆。 此外膜的孔徑大小也是考慮的重要因素。目的蛋白 30KD 以下用 0.22um 孔徑 的 NC 膜，30KD 以上用 0.45um 孔徑的 NC 膜 3. 轉(zhuǎn)印選擇恒流，每個轉(zhuǎn)印槽 150mA,10KD 以下轉(zhuǎn)印 40min，10-30kd 轉(zhuǎn)印 50min，30-100KD 轉(zhuǎn)印 70min，100kd 以上轉(zhuǎn)印 80min 轉(zhuǎn)印完畢可用麗春紅 S 染膜，檢測轉(zhuǎn)印是否成功 轉(zhuǎn)印結(jié)束后，去除 NC 膜置于麗春紅 S 溶液中，室溫 5-10min 即可看見紅色條 帶，用 TBS 洗數(shù)次即可洗掉紅色條帶進(jìn)行后續(xù)實驗 五． 封閉 1. 電泳轉(zhuǎn)膜過后，膜上其他沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的空白位置需要用封閉液加以封閉，以 避免一抗或二抗非特異性結(jié)合。這是由于 WB 的靈敏度很大程度上取決于封閉的 好壞，封閉時間過長（過度封閉）導(dǎo)致抗原表位的遮蔽，從而降低檢測靈敏度； 封閉時間過短（不*封閉）又會導(dǎo)致zui終背景增高或信噪比太低，因此封閉液 的選擇和條件的優(yōu)化很重要。 2. 封閉液中應(yīng)加入適量的防腐劑，避免封閉蛋白變性影響封閉效果。 六． 抗體的雜交 1. 若非特異性條帶過多，可適當(dāng)降低抗體的濃度，增加洗膜次數(shù)，蛋白電泳前延長 變性時間，減少上樣蛋白量，延長封閉時間。 2. 若信號弱：可能轉(zhuǎn)膜不*，可優(yōu)化轉(zhuǎn)移時間和電流；增加抗體的濃度；適當(dāng)延 長曝光時間。 3. 若背景較高：可適當(dāng)降低抗體的濃度，過濾二抗，延長封閉時間；增加漂洗時間； 減少曝光時間 七． 檢測 1. 膠片曝光幾秒到數(shù)分鐘，具體情況要看膜上化學(xué)發(fā)光條帶明暗強度而定。膠片 曝光時間不宜過長，時間過長會照成膠片背景變深。沖洗膠片以確定所測抗原 的正確曝光時間 2. 沖洗膠片的步驟：曝光完的膠片先在顯影液中沖洗至出現(xiàn)條帶為止，一般在 1min 以內(nèi)，時間過長也會照成膠片背景變深。再放入定影液中漂洗，十秒即可。顯 影液漂洗完后，要多用清水沖洗，以免定影液中成分殘留在膠片上。
