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Human IFN ELISpot

閱讀：438發(fā)布時(shí)間：2015-6-25

Human IFN ELISpot

Human IFN-γ ELISpot操作指導(dǎo)

A. 準(zhǔn)備和預(yù)包被板的封閉（無菌操作）

1． 從密封的包裝袋中拿出ELISpot板，用無菌PBS洗4次（200?l/孔）。

2． 用10%血清的*培養(yǎng)基封閉（200?l/孔），室溫孵育30分鐘。

B. 細(xì)胞的孵育（無菌操作）

1． 倒掉培養(yǎng)基，加入細(xì)胞懸液并加入刺激因子，如抗原（終體積100-150?l/孔）。用mAb CD3-2 為陽性對照。

2． 把板子放到37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育12-48小時(shí)。在此過程中不要移動(dòng)板子，并用鋁箔紙包上板子以避免邊緣效應(yīng)。 C. 斑點(diǎn)的檢測 1． 倒掉細(xì)胞，用PBS洗5次（200?l/孔）。 2． 用0.5%胎牛血清的PBS稀釋檢測抗體為1?g/ml，每孔加入100?l室溫孵育2小時(shí)。

3． 洗板5次。

4． 用0.5%胎牛血清的PBS 1:1000稀釋鏈霉親和素，每孔加入100?l室溫孵育1小時(shí)。

5． 洗板5次。

6． 通過0.45?m過濾器過濾底物（BCIP/NBT），每孔加入100?l，等待清晰的斑點(diǎn)形成。

7． 用自來水沖洗停止顯色，沖洗板子的后面。

8． 晾干板子。在顯微鏡下或用ELISpot計(jì)數(shù)儀對斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。

9． 室溫避光儲(chǔ)存板子。注意：如果是未包被的板子，在使用之前需要包被抗體，包被過程為：

1． 用無菌PH7.4 PBS稀釋包被抗體濃度為15?g/ml。

2． 從密封的包裝袋中拿出ELISpot板，每孔加入50?l 70%乙醇預(yù)濕。預(yù)濕時(shí)間不要超過2分鐘。

3． 晃動(dòng)板子盡快吹干，用無菌水洗5次，200?l/孔。

4． 每孔加入100?l抗體溶液，4℃過夜。


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