1. 注意事項(xiàng)：

1.1. 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好(log phase) 且存活率高之狀態(tài)，約為80 – 90 %致密度。

1.2. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì)，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。

1.3. 注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色(以0.22 micronFGLP flon 過(guò)濾或是直接購(gòu)買(mǎi)無(wú)菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。 1.4. 冷凍保存之細(xì)胞濃度：

1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma 會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24 小時(shí)后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依細(xì)胞種類(lèi)而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml。

1.5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 或10 % DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。

1.6. 冷凍方法： 1.6.1. 傳統(tǒng)方法: 4℃ 10 分鐘---> -20℃ 30 分鐘---> -80℃ 16 - 18 小時(shí)(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機(jī)以–1 ～ -3℃/分鐘之速度由室溫降至–120℃，放在液氮槽vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保存。

細(xì)胞冷凍保存：
2. 材料： 2.1. 生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞 2.2. 新鮮培養(yǎng)基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 無(wú)菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球計(jì)數(shù)盤(pán)與蓋玻片 2.7. 等速降溫機(jī)(KRYO 10 Series II)

3. 步驟： 3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情形。 3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，zui后濃度為5-10%，混合均勻，置于室溫下待用。 3.3. 依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1 ml) 計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。

3.4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。 3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16～18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中，再放入液氮槽中。