人內(nèi)皮型一氧化氮合酶ELISA試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中eNOS水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入eNOS抗原、生物素化的抗人eNOS抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的eNOS呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

試劑盒組成

1.酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，其濃度為10000 pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10000 pg/mL，5000 pg/mL ，2500 pg/mL，1250 pg/mL，625 pg/mL，310 pg/mL，156 pg/mL，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制5000 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 10000 pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3.樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.檢測(cè)稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.檢測(cè)稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.檢測(cè)溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

7.檢測(cè)溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。

8.底物溶液：1×10ml/瓶。

9.濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

標(biāo)本的采集及保存

1．血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。

1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品100ul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)120分鐘。

2.棄去液體，甩干，不用洗滌。

3.每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。

4.每孔加檢測(cè)溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。

5.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘（此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）。

6.依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)蘭色立轉(zhuǎn)黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。

注：

1． 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。