免疫印跡中免疫沉淀蛋白的制備
 
    1．對照   
    實驗對照的設(shè)置應(yīng)包括能與免疫抗體共沉淀的樣品和能與非免疫抗體共沉淀的樣品。通過兩者比較可以鑒別免疫抗體所識別的條帶和非特異性的背景條帶(如來自重鏈的條帶)。此外還應(yīng)該包括含有已知的或標準量的待測抗原的陽性樣品，陽性對照可以是含有已知或標準量待測抗原的任何樣品，來源于細菌或桿狀病毒超常表達系統(tǒng)或來源于已充分鑒定的細胞系。該樣品不必經(jīng)過免疫沉淀但應(yīng)在鄰近的膠道和其他樣品同時上樣電泳。它可提示免疫印跡是否成功，并對抗原的相對分子質(zhì)量進行比較。如果陽性對照中抗原的量是已知的，可粗略估計待測樣品中抗原的含量。
 
    2．準備工作
準備1個70℃水浴箱。
 
    3．需要的溶液
    不含DTT的Laemmli樣品緩沖液(20％SDS、10％甘油、60mmol／LTris，pH 6．8和0．01％溴酚藍)；
    lmol／LDTT(—20C貯存)
 
    4．操作步驟
    (1)將樣品緩沖液加入吸附抗原和抗體，并經(jīng)過洗滌的A蛋白或G蛋白微珠中。使樣品緩沖液和微珠的體積比率至少為2：1。5：1左右更好，但一般不超過10：1。
    Tris/GlycineSDS—PAGE樣品應(yīng)用緩沖液的條件是：2％SDS、100mmol／LDTT(取自—20T3存放的lmol／L貯存液，臨用前加入)、60mmol／LTris(pH 6．8)、0．01％溴酚藍和10％甘油。
    (2)樣品置70C水浴加熱至少5rain。除特殊情況外，在凝膠內(nèi)加樣之前不必去除微珠。
    至此，電泳樣品已準備就緒。
樣品既可立即使用也可凍存。—20C存放的樣品可穩(wěn)定保存數(shù)月。
 
    5．常見問題
    將免疫沉淀制備的蛋白用于免疫印跡時，來自免疫沉淀的抗體會出現(xiàn)在印跡膜上，該抗體可被二抗試劑檢出。通常抗體重鏈和輕鏈的大小并不干擾待測抗原的鑒定。然而，若待測抗原的大小在50kDa或25kDa左右(大約為重鏈和輕鏈多肽的大小)，有兩種解決辦法。一是可將免疫沉淀抗體共價結(jié)合在A蛋白或G蛋白微珠上；其二是采用直接檢測技術(shù)進行測定。