ELISA試劑盒聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)，是近年發(fā)展起來的一種體外擴增特 異DNA片段的技術(shù)。在1985年由Kary Mullis創(chuàng)立。此法操作簡便，短時間內(nèi)在試管中可獲得數(shù)百萬個特異DNA序列的拷貝。1993年Mullis因此獲得了諾貝爾獎。PCR技術(shù)已迅速滲透到分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域，在分子克隆、遺傳病的基因診斷、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等方面得到了廣泛的應(yīng)用，而且與PCR相關(guān)的技術(shù)不斷被開發(fā)應(yīng)用。目前大多數(shù)法醫(yī)DNA分析技術(shù)均以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)進行分型。 
    PCR技術(shù)實際上是模擬生物體內(nèi)的在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的體外DNA酶促合成反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA 結(jié)合的特異性，引物是PCR反應(yīng)中zui主要的成分。反應(yīng)分三步：(1)變性(denaturation)：首先是雙鏈DNA分子在95℃左右高溫下加熱，dna雙螺旋配對堿基間的氫鍵斷裂，雙鏈 解離成單鏈DNA；(2)退火(annealing)：降低溫度使引物和其互補的模板形成雜交鏈。由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜的多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA，模 板DNA雙鏈之間互補的機會較少； (3)延伸(extension)：在DNA聚合酶和4種脫氧核糖 核苷酸底物及Mg2+存在的條件下，聚合酶催化以引物為起始點的5′→3′方向的DNA鏈延伸反應(yīng)。 
    經(jīng)過高溫變性，低溫退火和中溫延伸3個溫度的循環(huán)，模板上介于兩個引物之間的序 列不斷得到擴增。每循環(huán)一次，目的DNA的拷貝數(shù)加倍，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，目的 DNA以指數(shù)的形式堆積，數(shù)量可達2 ×105～7拷貝。在反應(yīng)的zui初階段，原來的DNA擔(dān)負 著起始模板的作用，隨著循環(huán)次數(shù)的遞增，由引物引導(dǎo)延伸的片段急劇地增多而成為主要模板。因此，絕大多數(shù)擴增產(chǎn)物將受到所加引物5′末端的限制，zui終擴增產(chǎn)物是介于兩種引物5′端之間的dna片段。 
    在一個PCR體系中同時擴增多個基因座的方法叫做復(fù)合擴增（Multiplexing PCR）。復(fù)合擴增的PCR反應(yīng)體系仍由反應(yīng)緩沖液、dNTP、引物、模板、dna聚合酶及Mg2+組成，擴增的反應(yīng)體系組成和擴增熱循環(huán)條件相同，唯有引物是多對。復(fù)合擴增提高單次檢測的信息量，克服了單位擴增時必須分別加入引物，分別擴增，分別電泳的缺點。同時，復(fù)合擴增可以減少檢材用量。目前，銀染系統(tǒng)和熒光標(biāo)記自動檢測系統(tǒng)檢測多個基座時，通常都采用復(fù)合擴增的方法。 
PCR技術(shù)具有敏度高、特異性強、種屬特異性好、適于降解DNA檢材、擴增產(chǎn)物分析方法多樣化等特點，一些新的PCR相關(guān)技術(shù)在法醫(yī)DNA分析得到應(yīng)用.
  PCR—RFLP技術(shù) 
PCR—RFLP是在RFLP分析方法的基礎(chǔ)上發(fā)展建立的一種更為簡便的DNA分型技術(shù)。PCR—RFLP的基本原理是用PCR擴增目的DNA，擴增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶。此項技術(shù)大大提高了目的DNA的含量和相對特異性，而且方法簡便，分型時間短。已廣泛應(yīng)用于AB0、HLA、線粒體DNA等序列多態(tài)性分析中。 
PCR—RFLP與DNA—RFLP分型方法相比，雖有很大的改進，但酶切條件要求較高， 受影響因素較多，有時PCR擴增產(chǎn)物不能*被內(nèi)切酶消化切割；有時區(qū)分所有的等位基因比較困難。 
  PCR—SSO技術(shù) 
序列特異性寡核苷酸—聚合酶鏈反應(yīng)(Sequence Specific Oligonucleotide-PCR，PCR- SSO)或等位基因特異寡核苷酸—聚合酶鏈反應(yīng)(Allelic Specific Oligonucleotide- PCR，PCR-ASO)是利用合成與一種或多種等位基因特異堿基序列的互補寡核苷酸探針，并與特定片段的PCR擴增產(chǎn)物在一定離子強度的雜交液和溫度下進行雜交，雜交完畢后進行檢測判別有無結(jié)合。檢測有堿基序列差異的特定等位基因多態(tài)性。其檢測可采用放射性同位素或熒光免疫檢測系統(tǒng)。目前在國外多采用熒光標(biāo)記法。PCR—SSO是目前應(yīng)用zui多的一種簡單、快速而又的HLA—Ι、Ⅱ類DNA分型方法，能鑒定所有已知序列的HLA—A、B、DR、DQ、DP等位基因，地分析DNA的多態(tài)性。 
SSO方法的優(yōu)點是快速方便，可以在短時間內(nèi)檢測大量樣本。缺點是探針檢測的位點有限，某些未知的位點不能很好的被檢測出來。 
雜交反應(yīng)是在固定有探針或擴增產(chǎn)物的雜交膜上進行， 如把擴增產(chǎn)物先固定在膜上，用標(biāo)記好的已知序列的寡核苷酸探針去雜交檢測的稱“正向雜交”。反之，先將已知序列的寡核苷酸按順序固定在膜上，在PCR擴增過程中標(biāo)記擴增產(chǎn)物或在擴增后標(biāo)記擴增產(chǎn)物，用這種帶標(biāo)記的擴增產(chǎn)物與固定在膜上的寡核苷酸序列雜交來檢測擴增產(chǎn)物的序列，根據(jù)寡核苷酸在膜上固定的順序來確定待測等位基因的序列的方法，稱“反向雜交”。正向、反向雜交技術(shù)各有特點，正向雜交更適合于大批量篩選，反向雜交對較小數(shù)量分析更能體現(xiàn)它的優(yōu)點，目前反向雜交應(yīng)用較廣。 
PCR-ASO技術(shù)即把固相載體上固定的探針通過雜交檢測靶基因擴增片斷。PCR-ASO技術(shù)主要分四步進行：PCR擴增、雜交、顯示雜交信號、雜交結(jié)果的分析。在PCR緩沖液中加入大量DNTPs，生物素標(biāo)記結(jié)合引物和耐熱穩(wěn)定性DNA多聚酶，然后加入DNA樣品進行PCR擴增，引物用于擴增DNA序列的特異位點。加熱后，DNA螺旋的兩條帶分開（變性），引物的目的結(jié)合位點暴露。然后再降至某一特定溫度后，引物將與其互補的序列相結(jié)合（退火），然后，在另一個特定溫度下，熱穩(wěn)定性DNA聚合酶在大量DNTPs存在下沿著模板鏈擴增延長退火后，引物（延伸）以此方法一個循環(huán)后，兩個生物素標(biāo)記了的目的序列產(chǎn)生。經(jīng)過多次循環(huán)，大量的生物素標(biāo)記的目的基因序列產(chǎn)生擴增后的生物素?；疍NA樣品經(jīng)化學(xué)變性，每條鏈與固定基試劑條上的等位基因線列特異性的寡核苷酸探針雜交。然后快速沖洗以去除所有錯配的擴增DNA。沖洗后加入堿性磷酸酶結(jié)合的鏈親合素，使之與生物素?；碾s交產(chǎn)物結(jié)合，然后再與包含染色劑的底物溶液一起孵育產(chǎn)生紫色/棕色沉淀。沖洗以終止反應(yīng)，用探針的反應(yīng)格局表記錄結(jié)果。

ELISA試劑盒