在建立ELISA試劑盒方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明，兩次抗原 抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2 小時，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。由于公司的 試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。
另外溫育中還有邊緣效應(yīng)，邊上的值會偏高，建議為了客觀的判斷結(jié)果，將質(zhì)控放在非邊緣位置。96孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特別；易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對溫度有嚴(yán)格要求，酶標(biāo)板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異；干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。
洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液，各種 試劑盒的洗液不要混用。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。洗液需要稀釋，應(yīng)按要求稀釋。
配制洗液應(yīng)用新鮮的和高質(zhì)量的純化水，電導(dǎo)率小于1.5μs/cm，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制。手洗條件一致性較差，對結(jié)果影響較大，防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。半自動與全自動冼板機(jī)使用不當(dāng)也會影響結(jié)果，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)針小孔全阻塞或半阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不*，導(dǎo)致“花板"造成假陽性或假陰性；ELISA試劑盒所以操作洗板機(jī)過程中要不時觀察洗板機(jī)針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，及時糾正，洗板機(jī)不用時應(yīng)用去離子水清冼幾遍。⑴ 嚴(yán)格按照試劑。操作前將試劑在室溫下平衡30～60min。
⑵ 加樣后及時放人孵箱。標(biāo)本較多時，要分批操作。按說明步驟嚴(yán)格控制操作時間，防止孵育時間人為延長，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗*。
（3）封板溫育時，各孔一定要封嚴(yán)，防止陽性標(biāo)本的液體蒸發(fā)，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“花板"的出現(xiàn)。
（4）用洗板機(jī)洗板時，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙（選擇干凈、無或少塵的吸水材料）上輕輕拍干：還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象而導(dǎo)致“花板"的出現(xiàn)。
（5）合理安排檢測量，以免反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長。
（6）加酶試劑后用吸水紙在酶標(biāo)板表面輕拭吸干。
（7）顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，ELISA試劑盒肉眼可見淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用。
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