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多酚氧化酶的測(cè)定方法

閱讀:344發(fā)布時(shí)間:2015-03-05

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多酚氧化酶試劑:

1、0.02mol/l焦兒茶酚溶液:稱0.22克焦兒茶酚溶于100毫升蒸餾水中,現(xiàn)用現(xiàn)配。

2、0.1mol/l*:0.3567克*溶于蒸餾水,定容至100毫升。

3、0.005mol/l碘液:*2.5克溶于200毫升蒸餾水中,加冰醋酸1毫升,再加0.1mol/l*12.5毫升,zui后加蒸餾水定容至250毫升。

4、pH6.0磷酸緩沖液:87.7毫升A+12.3毫升B,用蒸餾水稀釋至200毫升。

貯備液A:0.2mol/l*(27.6g NaH2PO4·H2O用蒸餾水配成1000ml)。

貯備液B:0.2mol/l*(53.65g Na2HPO4·7H2O或71.7g Na2HPO4·12H2O用蒸餾水配成1000毫升)

5、其它:1%淀粉;10%偏磷酸;0.1%抗壞血酸(現(xiàn)用現(xiàn)配)

多酚氧化酶方法:

1、粗酶提?。悍Q取新鮮樣品2克,剪碎,置于研缽中,加入少量pH6.0磷酸緩沖液和少許石英砂,于冰浴中迅速研磨至勻漿,將全部材料用緩沖液沖洗入50毫升容量瓶中,并定容至刻度。在18~20度下每隔3分鐘搖動(dòng)1次,共5次,然后再靜置15~20分鐘,其上清液即為粗酶提取液(可傾入干潔的三角瓶中備用)。

2、活性測(cè)定:取干潔50毫升三角瓶6只(編號(hào)),按照下表向各瓶中加入pH6.0磷酸緩沖液、0.1%抗壞血酸、0.02mol/l焦兒茶酚,并向③號(hào)瓶及⑥號(hào)瓶各加10%偏磷酸。然后將三角瓶置于18~20度水浴或放在室溫下使內(nèi)外溫度達(dá)到平衡之后,每隔1分鐘向各瓶中依次加入酶液2毫升,全部加完后保溫3分鐘,再按原順序仍然間隔1分鐘向①、②、④、⑤號(hào)各瓶加入偏磷酸1毫升(注意:加完2號(hào)瓶后應(yīng)間隔2分鐘再加4號(hào)瓶),用于終止酶的活性。zui后向各瓶中加入1%淀粉溶液3滴作為指示劑,搖勻后用微量滴定管以0.005mol/l碘液滴定,當(dāng)溶液呈現(xiàn)淡藍(lán)色為止,記錄碘液消耗量。

3、結(jié)果計(jì)算:A多酚=0.44*V1/V2/W/t

V1:提取時(shí)酶液總量(毫升)  V2:測(cè)定時(shí)酶液用量(毫升)

 ①、②、③、④、⑤、⑥:測(cè)定時(shí)消耗碘液量(毫升)  t:酶反應(yīng)時(shí)間(分)


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