酵母細(xì)胞的培養(yǎng)
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />1．掌握酵母細(xì)胞的培養(yǎng)方法
2．學(xué)會(huì)使用相差和微分干涉顯微鏡
二、異源互補(bǔ)技術(shù)概述
釀酒（芽殖）酵母的培養(yǎng)在許多方面可以與大腸桿菌相比較。這種酵母可以用標(biāo)準(zhǔn)的微生物學(xué)技術(shù)在液體和固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。大多數(shù)酵母菌株在復(fù)合液體培養(yǎng)基中的倍增時(shí)間為90～120min，到靜止期時(shí)細(xì)胞滴度為3×108到5×108細(xì)胞/mL。單個(gè)細(xì)胞在復(fù)合固體培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)36 hr可長(zhǎng)成1～2mm的單菌落，在合成的有限培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較慢，倍增時(shí)間至少增加為原來(lái)的兩倍，且細(xì)胞的zui終滴度僅達(dá)到2×107到3×107細(xì)胞/mL。在有限培養(yǎng)基平板上菌落需大約60 hr才能長(zhǎng)成容易計(jì)數(shù)的大小。在復(fù)合或有限培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落能影印培養(yǎng)或轉(zhuǎn)移到膜上，進(jìn)行分子水平的分析。
非洲粟酒裂殖酵母和其近親釀酒酵母一樣，是一種子囊真菌，但它與發(fā)芽酵母的關(guān)系并不密切，兩種酵母的蛋白質(zhì)序列和基因同源性在60﹪到90﹪。與釀酒酵母相比，非洲粟酒裂殖酵母通常是單倍體細(xì)胞，可分為兩種交配型，在饑餓情況下不同的交配型單倍體進(jìn)行交配，形成雜合的雙倍體合子。雙倍體合子經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂形成4個(gè)孢子，由孢子發(fā)芽而長(zhǎng)成單倍體菌落。非洲粟酒裂殖酵母具有典型的真核生物的細(xì)胞周期，包括G1、S、G2和M 四個(gè)時(shí)期。在基本或復(fù)合培養(yǎng)基中其世代時(shí)間為2到4個(gè)h，其中G2期占細(xì)胞周期的70﹪，其它期各占10﹪。
三、材料、試劑和儀器
1． 材料
釀酒芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）和非洲粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces kephir）。
2． 試劑
人紅細(xì)胞刺激因子（ESF）ELISA 試劑盒
人腫瘤壞死因子相關(guān)激活誘導(dǎo)因子（TRANCE）ELISA 試劑盒
人生長(zhǎng)激素釋放因子（GH-RF）ELISA試劑盒
人巨噬細(xì)胞趨化因子（MCF）ELISA 試劑盒
人α/β干擾素受體（IFN-α/βR）ELISA 試劑盒
人B細(xì)胞生長(zhǎng)因子（BCGF）ELISA 試劑盒
人B細(xì)胞分化因子（BCDF）ELISA 試劑盒
人上皮細(xì)胞粘附分子（Ep-CAM/CD362）ELISA 試劑盒
人可溶性粘附分子（Sam）ELISA 試劑盒
人巨噬細(xì)胞替代激活相關(guān)化學(xué)因子1（AmAC-1）ELISA 試劑盒
人可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR-2/sFLK-1）ELISA 試劑盒
人胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）ELISA 試劑盒
人穿孔素/成孔蛋白（PF/PFP）ELISA試劑盒
人多效生長(zhǎng)因子（PTN）ELISA試劑盒
人可溶性CD28（sCD28）ELISA試劑盒
人淋巴細(xì)胞因子ELISA 試劑盒
人胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子（TARC/CCL17）ELISA 試劑盒
人神經(jīng)細(xì)胞粘附分子配體1（NCAM-L1/CD171）ELISA試劑盒
人神經(jīng)保護(hù)因子（CVNPF）ELISA 試劑盒
人可溶性腫瘤壞死因子α受體（sTNFαR）ELISA試劑盒
人可溶性細(xì)胞因子受體（sCKR）ELISA試劑盒
人可溶性凋亡相關(guān)因子配體（sFASL）ELISA 試劑盒
人細(xì)胞凋亡抑制因子（IAP）ELISA 試劑盒
人集落刺激因子（CSF）ELISA 試劑盒
人γ干擾素誘導(dǎo)單核細(xì)胞因子（MIGF/CXCL9）ELISA 試劑盒
人干擾素誘導(dǎo)T細(xì)胞趨化因子（ITAC/CXCL11）ELISA 試劑盒
人CD14分子（CDl4）ELISA 試劑盒
人凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）ELISA 試劑盒
1）釀酒芽殖酵母的培養(yǎng)基
（1）YPD（YPED）液體培養(yǎng)基（用于酵母菌搖培，100mL）
細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨（Bacto-peptone） 2g
細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 （Bacto-Yeast extract） 1g
葡萄糖（Glucose，配成40%detrose貯液?jiǎn)为?dú)滅菌,4℃保存） 2g
加ddH2O至90mL，調(diào)pH值至4-5，定容至95mL，高溫滅菌（121℃,15min）。待溫度降至55℃時(shí)，加入5mL預(yù)熱（至少室溫放置30min）無(wú)菌的40％detrose貯液。
（2）YPD（YPED）固體培養(yǎng)基（可用于保菌或培養(yǎng)，100mL）
在YPD液體培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物中加入2g瓊脂粉，加ddH2O至90mL，調(diào)pH值至5.8，定容至95mL，高溫滅菌（121℃, 15min）。待溫度降至55℃時(shí)，加入5mL預(yù)熱（至少室溫放置30min）無(wú)菌的40％ detrose貯液。
（3）YPAD（斜面）培養(yǎng)基（可用于保菌或培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株，100mL）
在YPD液體培養(yǎng)基中加入硫酸腺嘌呤（Adenine hemisulfate salt，腺嘌呤半硫酸鹽）40mg，瓊脂（Bacto-agar）（液體培養(yǎng)基不加）2g。加ddH2O至90mL，調(diào)pH值至5.8（液體調(diào)至4左右），定容至95mL，高溫滅菌（121℃,15min）。待溫度降至55℃時(shí)，加入5mL預(yù)熱（至少室溫放置30min）無(wú)菌的40％detrose貯液。分裝培養(yǎng)基，傾斜放置形成斜面，每支試管依大小可加入3-5mL培養(yǎng)基。（若葡萄糖直接加入培養(yǎng)基則可先分裝至試管后滅菌（需要棉塞），滅菌會(huì)造成葡萄糖碳化，培養(yǎng)基略變褐色，對(duì)酵母培養(yǎng)會(huì)略有影響）。該培養(yǎng)基用于4-6個(gè)月的短暫保菌或酵母培養(yǎng)。
人白細(xì)胞共同抗原（LCA/CD45）ELISA 試劑盒
人CD4分子（CD4）ELISA 試劑盒
人P鈣黏蛋白/胎盤(pán)鈣黏蛋白（P-cad）ELISA 試劑盒
人角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子（KGF）ELISA 試劑盒
人血小板衍生生長(zhǎng)因子BB（PDGF-BB）ELISA試劑盒
人CXC趨化因子配體16（CXCL16）ELISA 試劑盒
人CXC趨化因子受體3（CXCR3）ELISA 試劑盒
人γ干擾素誘導(dǎo)蛋白16/p16（IFI16/p16）ELISA 試劑盒
人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1a（SDF-1a/CXCL12）ELISA 試劑盒
人淋巴細(xì)胞趨化因子（Lptn/LTN/XCL1）ELISA 試劑盒
人α干擾素（IFN-α）ELISA試劑盒
人可溶性CD86（B7-2/sCD86）ELISA 試劑盒
人白介素27（IL-27）ELISA試劑盒
人白介素23（IL-23）ELISA試劑盒
人巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）ELISA試劑盒
人組織因子途徑抑制物（TFPI）ELISA 試劑盒
人干擾素誘導(dǎo)蛋白10（IP-10/CXCL10）ELISA 試劑盒
人白介素1（IL-1）ELISA 試劑盒
人白介素17（IL-17）ELISA 試劑盒
人白介素1β （IL-1β）ELISA 試劑盒
人表皮生長(zhǎng)因子（EGF）ELISA 試劑盒
人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）ELISA試劑盒
人巨噬細(xì)胞炎性蛋白5（MIP-5）ELISA試劑盒
人可溶性E選擇素（sE-selectin）ELISA 試劑盒
人可溶性細(xì)胞間粘附分子1（sICAM-1）ELISA試劑盒
人細(xì)胞間粘附分子2（ICAM-2/CD102）ELISA 試劑盒
2）非洲粟酒裂殖酵母的培養(yǎng)基
（1）YE培養(yǎng)基（100mL）
酵母提取物 0.5g
葡萄糖（Glucose，配成40%detrose貯液?jiǎn)为?dú)滅菌，4℃保存） 2g
細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂（Bacto-agar） 2g
加ddH2O至90mL，調(diào)pH值至5-6，定容至95mL，高溫滅菌（121℃,15min）。待溫度降至55℃時(shí)，加入5mL預(yù)熱（至少室溫放置30min）無(wú)菌的40％detrose貯液。
