抗體水平測定法

1．本次實驗的目的和要求
掌握雞新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗體水平測定法，以便檢查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。
2．實驗內容或原理
    某些病毒（如新城疫病毒，禽流感病毒等）能夠與動物的紅細胞發(fā)生凝集，此即為紅細胞凝集現(xiàn)象（HA）。這種紅細胞凝集現(xiàn)象可于病毒懸液中加入特異免疫血清所抑制，即為紅細胞凝集抑制試驗（HI）。
3．需用的儀器或試劑等
動物 健康成雞2-5只，被檢雞15-25只。
器材 高壓滅菌器、濾紙、試管、試管架、離心機、離心管、三棱針、內徑2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精燈、石蠟、96孔V型微量凝集試驗板、0.025mm微量吸液器、微型振蕩器、微量移液器、脫脂棉等。
藥劑（1）濃縮抗原；（2）生理鹽水或磷酸緩沖鹽水（PBS）；（3）Alsever細胞保存液；（4）紅細胞懸液；（5）待檢血清
4．實驗步驟
（1）發(fā)現(xiàn)與鑒定病毒：雞新城疫和禽流感病毒分離后，這些病毒能凝集雞的紅細胞，又能被特異性的已知免疫血清抑制其凝集反應，即可鑒定此病毒。
 （2）診斷病毒性疾?。喝缛⊥话l(fā)病的動物早期和恢復期血清進行紅細胞凝集抑制實驗，如抗體效價有4倍以上升高，即有診斷意義。
（3）免疫機體抗體效價的測定：
 3.雞新城疫（ND）的HA和HI
（1）試驗準備  
 ① 抗原：一般以雞新城疫Ⅱ系或LaUra系凍干苗作為已知抗原，進行試驗。
 ② 0.7％細胞懸浮液：由雞翅靜脈或心臟采血，放入含有抗凝劑的滅菌試管（按每毫升血加入3.8％滅菌檸檬酸鈉0.2毫升做抗凝劑）內，迅速混勻。如當時不用，可直接采血放入紅細胞保存液內（保存液2份，血液1份）于4℃冰箱內可保存兩周。
紅細胞懸液的配制：將血液注入離心管中，經(jīng)3000轉／分鐘，離心5-10分鐘，用吸管吸去上清液和紅細胞上層的白細胞薄膜，將沉淀的紅細胞加稀釋液（生理鹽水）洗滌。再用離心機3000轉／分鐘離心5-10分鐘，棄上清，再加稀釋液洗滌，如此反復洗滌三次，將zui后一次離心后的紅細胞泥，按0.7％的稀釋度加入稀釋液（0.7毫升紅細胞泥加99.3毫升稀釋液）。
 ③ 被檢血清：將被檢雞群編號登記，用消毒過的干燥注射器采血，注入潔凈干燥試管內（微量法可用孔徑2-3毫米塑料管由翅靜脈采血），在室溫中靜置或離心，待血清析出后使用。每只雞應更換一個注射器，嚴禁交叉使用。
④ 稀釋液：為滅菌的生理鹽水。
⑤ 紅細胞保存液的配制方法：葡萄糖2.05克，檸檬酸鈉（SHOO）0.80克，檸檬酸（2H20）0.055克，氯化鈉0.42克，蒸餾水加至100毫升。過濾分裝，高壓滅菌10分鐘，放4℃冰箱保存。
（2）紅細胞凝集試驗（HA）   主要是測定病毒的紅細胞凝集價，以確定紅細胞凝集抑制試驗所用病毒稀釋倍數(shù)（抗原單位）。
雞新城疫病毒的HA試驗與HI試驗現(xiàn)采用微量法，以u或v形微孔塑料板代替試管。
① 首先用移液器向每個孔加入稀釋液一滴（0.05毫升）。
② 用微量移液器取病毒抗原0.05毫升，加入*孔，反復抽動6次后，吸出0.05毫升加入第二孔，在第二孔反復抽動6次后，吸出0.05毫升加入第三孔，如此連續(xù)稀釋至第十一孔后吸出0.05毫升棄去。第12孔不加病毒液為紅細胞空白對照。

人胎兒胸腺細胞株HFT-8810  
人前列腺上皮細胞RWPE-1  
人前列腺正常細胞RWPE-2  
人男性正常龜頭細胞Hs68  
人整合 SV40基因的乳腺上皮細胞HBL-100  
人前列腺癌細胞DU 145  
人乳腺癌細胞MDA-MB-231  
人前列腺癌細胞LNCaP  
人乳腺癌細胞MCF 7B  
人乳腺癌細胞MDA-MB-157  
人乳腺導管癌細胞ZR-75-1  
人乳腺導管瘤細胞UACC812  
人前列腺癌高轉移細胞株PC-3M-IE8  
人前列腺癌低轉移細胞株PC-3M-2B4  
人乳腺導管癌細胞HCC38  
人乳腺導管癌細胞ZR-75-30  
人乳腺癌瘤株MCF7  
人乳腺癌細胞BT-20  
人乳腺導管癌細胞BT-549  
人乳腺導管癌細胞MDA-MB-175Ⅶ  
人乳腺癌細胞MDA-MB-415  
人乳腺導管癌細胞MDA-MB-435  
人乳腺癌細胞MDA-MB-436  
人乳腺癌細胞Bcap-37  
人前列腺癌細胞LNCaP clone FGC  
人乳腺癌細胞MDA-MB-453  
人乳腺癌細胞MDA-MB-435S  
人乳腺癌細胞SK-BR-3  
人髓狀甲狀腺腫瘤細胞TT  
人乳腺導管癌細胞T47D  
人乳腺癌細胞BT-549  
人前列腺癌細胞22Rv1  

人紅白細胞白血病細胞HEL細胞 （凍存、復蘇）
人乳腺癌細胞MDA-MB-468  
人甲狀腺鱗癌細胞SW579  
人乳腺癌細胞Hs 578T  
人乳腺癌細胞MDA-MB-468-06  
人乳腺導管瘤細胞BT-474  
人乳腺癌細胞HCC1937  
人前列腺癌細胞PC-3  
人乳腺癌細胞ZR-75-30  
人乳腺癌細胞MCF7  
人乳腺癌細胞BC－009  
人乳腺癌細胞BC－019  
人乳腺癌細胞BC－020  
人乳腺癌細胞BC－021  
人乳腺癌細胞BC－022  

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細胞介紹：

細胞名稱      小鼠胚胎成纖維細胞；3T3-Swiss albino
形態(tài)特性       成纖維細胞樣
生長特性      貼壁生長
特征特性       3T3細胞株是1962年Todaro G和Green H從分離的瑞士小鼠胚胎中建立的；該細胞的生長受接觸性抑制，匯合狀態(tài)的單層細胞密度為40000個細胞/平方厘米；檢測結果顯示該細胞鼠痘病毒陰性；在塑料瓶中生長較好，在某些玻璃表面上可能狀態(tài)不佳；細胞生長飽和時其密度可以達到約50000 cells/cm2。
培養(yǎng)條件       DMEM-H: Dulbecco's Modified Eagle's Medium （DME H-21 4.5g/Liter Glucose）  10%FBS
傳代方法       1:3傳代；3~4天1次。
傳代情況      C5
凍存條件       基礎培養(yǎng)基+5%DMSO+20%FBS
支原體檢測      培養(yǎng)法（-）