小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)方法原理 將小鼠的肝細(xì)胞從機(jī)體中取出,經(jīng)胰酶、螯合劑(常用EDTA)處理,分散成單細(xì)胞,置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖。
實(shí)驗(yàn)材料小鼠
試劑、試劑盒DMEM無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基胰酶PBS
儀器、耗材飯盒紗布剪子鑷子燒杯平皿研磨玻片濾網(wǎng)離心管6孔培養(yǎng)板吸管移液管手套微量加樣器
實(shí)驗(yàn)步驟
一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1. 動(dòng)物:小鼠。
2. 試劑:DMEM(含血清)、無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基、胰酶、PBS。
3. 器械:飯盒、紗布、小剪子、小鑷子、大鑷子、大燒杯、平皿、研磨玻片、濾網(wǎng)、離心管(15/50 ml)、6孔培養(yǎng)板、吸管、移液管、手套、微量加樣器。
小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)4. 準(zhǔn)備:酒精擦拭臺(tái)面后把物品擺放好,開(kāi)紫外線(xiàn)燈照30分鐘后開(kāi)鼓風(fēng)機(jī)吹至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
二、方法
1. 將小鼠斷頸致死,置75%酒精泡2-3秒鐘,取肝臟,置于盛有PBS的平皿中。
2. 剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物,轉(zhuǎn)移到另一個(gè)盛有PBS液的平皿中。
2.3 用手術(shù)剪將臟器剪成小塊(大小約1mm2),玻片研磨,轉(zhuǎn)到離心管,離心(1 000 rpm,5 min)。
4. 視組織或細(xì)胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶,37℃中消化20分鐘,每隔5分鐘振蕩一次,或用吸管吹打一次,使細(xì)胞分離。
5. 加入3-5 ml含血清的培養(yǎng)液以中止胰酶消化作用。
6. 用100目孔徑濾網(wǎng)濾過(guò),除去未消化的大組織塊。
7. 再次離心5 min,棄上清液。
小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)8. 加入無(wú)血清培養(yǎng)液5 ml,沖散細(xì)胞,再離心一次,棄上清液。
9. 加入含血清的培養(yǎng)液1-2 ml(視細(xì)胞量),血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
10. 將細(xì)胞調(diào)整到5×105/ml左右,轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板中,37℃下培養(yǎng)。