科研抗體 膠體金標(biāo)記蛋白A技術(shù)
PAg復(fù)合物制備方法簡(jiǎn)便，作為第二抗體，無(wú)種屬特異性，可以免去不同種屬動(dòng)物要制備不同的特異性免疫球蛋白。PAg 復(fù)合物與包埋劑和細(xì)胞成分都極少發(fā)生非特異性的交互作用，蛋白A和金粒間非共價(jià)的結(jié)合特性既不影響蛋白A的活性，又能保持高度的穩(wěn)定性，PAg復(fù)合物分子zui小易于穿透組織。PAg復(fù)合物的原液在4℃可保存達(dá)一年之久。電鏡水平的PAg染色法 PAg法在電鏡技術(shù)的應(yīng)用原則是二步標(biāo)記法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要區(qū)別于一般膠體金免疫染色在：①須1%卵白蛋白－PBs （pH7.4）或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris緩沖液（pH7.4）來(lái)封閉非特異性的結(jié)合部位，而不是采用羊或其它的動(dòng)物的正?？寡澹?yàn)镻Ag復(fù)合物能夠與正常血清組中的Ig結(jié)合，從而給出假陽(yáng)性結(jié)果；②在應(yīng)用*抗血清孵育和PBS沖洗后作第二抗血清即PAg復(fù)合物孵育前的準(zhǔn)備時(shí)，應(yīng)用的PBS或TBS的pH應(yīng)變更為pH8.2。其它可參照本節(jié)中包埋后染色法進(jìn)行。
液體配制：
科研抗體 膠體金標(biāo)記蛋白A技術(shù)1、膠體金稀釋液配方：
（PH＝8.2）的0.02mo1／L Tris TBS緩沖液，加入試劑級(jí)卵清白蛋白至1％。｛免疫電鏡按1：20-50稀釋，淡紅色為適宜稀釋液,膠體金稀釋后應(yīng)于當(dāng)天使用，未用完的應(yīng)該丟棄。（免疫膠體金說(shuō)明書）｝
2、清洗液：
0.5mol／L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液：Tris，60.57g，1mol／L Hcl約420m1，調(diào)pH值至7.4，zui后加雙蒸水至1000m1，此為儲(chǔ)備液。
0.05mo1／L Tris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.5-9g；0.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液100m1；加雙蒸水至1000m1，調(diào)pH值至7.4。
0.02mo1／LTris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.5-9g；o.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液40m1，加雙蒸水至l000m1，調(diào)pH值至8.2。
3、H2O2的配制:3% H2O2
4、8％過(guò)碘酸鈉水溶液
5、封閉液：
前封閉液：1%卵白蛋白—0.05mo1／LTris緩沖液（pH7.4）；
后封閉液以及膠體金稀釋液：1%卵白蛋白—0.02mo1／LTris緩沖液（pH8.2），后封閉為膠體金結(jié)合作準(zhǔn)備。
具體操作:
一、包埋：
常規(guī)電鏡制樣，樣品只需要戊二醛固定，不需要鋨酸后固定。丙酮梯度脫水時(shí)70％的丙酮中沒(méi)有添加染色劑。樣品于37度烘箱中固化。
二、切片：
超薄切片厚50～70nm左右，載于300網(wǎng)孔的鎳網(wǎng)上。
抗原修復(fù)：
科研抗體 膠體金標(biāo)記蛋白A技術(shù)1、置1%H2O2內(nèi)10min至1h（視樹(shù)脂的硬度和切片的厚度而定），以去鋨酸和增進(jìn)樹(shù)脂穿透性，有利抗體進(jìn)入。如切片很薄或于低溫包埋時(shí)，此步可省略。操作時(shí)，滴入1%H2O2液1滴于蠟板上，將網(wǎng)的載片面輕浮于液滴上。對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)切片，有主張以1%過(guò)碘酸鉀（KIO4）代替H2O2的。
（同時(shí)用8％過(guò)碘酸鈉水溶液代替雙氧水，室溫5～25分鐘以及丙酮對(duì)環(huán)氧樹(shù)脂進(jìn)行溶解?？慈吣莻€(gè)效果）
2、雙蒸水洗3次，每次10min，第1，2次浮于液滴上清洗，第3次以盛雙蒸水的注射器沿鎳網(wǎng)面沖洗，水流應(yīng)有適當(dāng)壓力，但不宜過(guò)高強(qiáng)，用濾紙?jiān)诰W(wǎng)緣將水吸干。（0.05mo1／L TBS pH7.4洗5min×3次?）
三、封閉以及免疫反應(yīng)：
1、載有超薄片的鎳網(wǎng)或金網(wǎng)浮于1%卵白蛋白－TBS（7.4）液滴上，室溫約1h，阻斷非特異性吸附，吸去多余血清，不洗。
2、載網(wǎng)直接移至*抗血清液滴上（抗體稀釋度較常規(guī)免疫組化低l倍），在室溫孵育2h或4℃18～24h。
3、0.05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。0.02mo1／L TBS PH8.2，洗5min×3次。1％卵清白蛋白0.02mo1／L TBS（8.2） 37℃孵育l h，再次阻斷非特異性吸附，吸去多余液體，不洗。
4、將PAg原液稀釋10～20倍（1：30～1：100，淡紅色為適宜稀釋液），載網(wǎng)浮于該液滴上，室溫孵育10min至1h（37℃孵育2h？）。
5、0.02mo1／L TBS pH8.2，洗5min×3次。0.05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。zui后切片浸于0.05m01／L TBS pH7.4緩沖液中，送電鏡室處理（含2%戊二醛及3%多聚甲醛的TBS液固定30分鐘？）。
