轉(zhuǎn)氨基作用 BD培養(yǎng)基
一．目的
了解動物組織的轉(zhuǎn)氨基作用，學(xué)習(xí)轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)產(chǎn)物的紙層析鑒定方法。
二．原理
氨基酸在體內(nèi)分解代謝的主要方式是脫氨基作用。脫氨基作用的主要方式有氧化脫氨基、轉(zhuǎn)氨基、聯(lián)合脫氨基及非氧化脫氨基。轉(zhuǎn)氨基是指在轉(zhuǎn)氨酶的催化下，氨基酸的α-氨基與α-酮酸的α酮基的互換反應(yīng)。轉(zhuǎn)氨酶廣泛分布于動物體的各器官組織中，各種轉(zhuǎn)氨基作用都有專一的轉(zhuǎn)氨酶催化。
本實(shí)驗(yàn)將谷氨酸和丙酮酸與肝勻漿一起保溫，在肝細(xì)胞的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化下產(chǎn)生丙氨酸。利用紙層析法鑒定丙氨酸的存在，證明組織內(nèi)的轉(zhuǎn)氨基作用。為了防止底物丙酮酸被組織中其它酶所氧化或還原，可加碘乙酸（或溴乙酸）抑制糖的酵解作用和氧化作用。
轉(zhuǎn)氨基作用 BD培養(yǎng)基
結(jié)果： 丙氨酸和α酮戊二酸 沒有反應(yīng)產(chǎn)物
用紙層析法鑒定轉(zhuǎn)氨基產(chǎn)物丙氨酸的存在與否。原理為：谷氨酸和丙氨酸是理化性質(zhì)不同的兩種氨基酸，前者為親水性氨基酸，后者為疏水性氨基酸，據(jù)此二者在固定相（水）與流動相（酚試劑）中的分配程度不同，因而流速不同。zui后用茚三酮顯色。
三．材料
（一）儀器 試管；離心管；離心機(jī)；剪刀及鑷子；培養(yǎng)皿；表面皿；毛細(xì)管；噴霧器；吹風(fēng)機(jī)。
（二）試劑
1．0.1%丙氨酸溶液
2．1%谷氨酸溶液
3．1%丙酮酸鈉溶液
4．0.25%碘乙酸溶液
5．0.01 mol/LpH7.4磷酸緩沖液
6．0.1%茚三酮乙醇溶液
7．層析溶劑（酚的飽和水溶液）
四．方法
（一）肝勻漿的制備 取新鮮動物肝臟1克，置研缽中剪碎，加細(xì)砂少許，5ml預(yù)冷的0.01 mol/LpH7.4磷酸緩沖液，研磨成勻漿。
（二）轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)
1．取小試管2支，分別標(biāo)明測定和對照，各加肝勻漿10滴，將對照管立即置沸水浴中10分鐘，取出冷卻。
2．兩管各加1%谷氨酸10滴，1%丙酮酸鈉10滴，0.25%碘乙酸5滴，置40℃水浴中保溫30分鐘后取出。
3．兩管各加5%三氯醋酸2滴，置沸水浴中5分鐘（2000rpm），將上清液分別移入同樣編號的小試管中備用。 轉(zhuǎn)氨基作用 BD培養(yǎng)基
（三）層析驗(yàn)證
1．取直徑13cm圓形濾紙一張，用鉛筆過圓心作兩條相互垂直的線，在每條線上距圓心1cm處打點(diǎn)作記，作為點(diǎn)樣處，并分別在其邊緣標(biāo)上測、谷、對、丙字樣，見圖9。
2．用毛細(xì)玻璃管分別蘸取測定液、1%谷氨酸溶液、對照液、0.1%丙氨酸溶液各一小滴，在濾紙上相應(yīng)點(diǎn)樣處點(diǎn)樣2μl，點(diǎn)樣斑點(diǎn)的直徑不超過3mm。
3．用大頭針在濾紙圓心扎一小孔（約1mm直徑），另取濾紙條（0.5×2.5cm），卷成筒狀，捻緊如燈芯，從濾紙上相應(yīng)點(diǎn)樣背面插入小孔，突出濾紙面約1cm。
4．加約2.5ml層析溶劑于直徑為5cm的表面皿中，表面皿放在直徑為10cm培養(yǎng)皿正中，將濾紙平放在培養(yǎng)皿上，使濾紙芯浸入層溶劑，取另一同樣大小的培養(yǎng)皿反向蓋上。層析溶劑沿濾紙芯上升到濾紙，并向四周擴(kuò)散，待溶劑前沿距濾紙邊緣1.5cm時，即可取出（層析時間約50分鐘）。用鉛筆劃出溶劑前沿后，用吹風(fēng)機(jī)或電爐烘干。
5．顯色 將濾紙平放于培養(yǎng)皿上，噴霧0.1%茚三酮乙醇溶液，再用吹風(fēng)機(jī)或電爐烘干。觀察層析出現(xiàn)的弧形紫色斑，并用鉛筆描出。計算各色斑的Rf值。
注意事項(xiàng)：操作中接觸濾紙前要洗手擦凈，并盡量避免手與濾紙中間部位接觸。
